1.擴增產物大小不合適：實時熒光定量PCR擴增片段的長度通常在80-150 bp之間，如果調整反應的時間有可能擴增500bp的片段。
2.PCR反應過程中退火及延伸的時間過短或過長：應根據擴增片段的大小予與調整。
3.MgCl,濃度不合適：按0. 5mm的間距調整MgCI2的濃度。
4.循環數設置不足：最少設置35個循環，可以增加到45個循環。超過45個循環以上背景信號會增加，對實驗結果的分析造成干擾。
5.在錯誤的PCR反應步驟采集信號：應檢查程序設置確保信號的采集是在退火的步驟進行的。
6.加樣的誤差及錯誤：注意每次加樣的一致性及移液器的校正。
7.DNA模板的起始濃度過低，不能被檢測出來：如果模板的濃度未知，最初的實驗可以采用較高濃度的模板并進行梯度稀釋。最高的模板濃度不超過500ng基因組DNA。
8.模板DNA的降解：使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA模板是否降解，檢查DNA模板的儲存條件是否合適，如果確認降解應重新制備新鮮的DNA模板。
9.梯度稀釋標準樣品的方法不規范:應注意梯度稀釋樣品的操作規范，準確。
10.引物或探針設計有誤，存在二級結構：通過瓊脂糖凝膠電泳檢測熒光定量PCR反應結果，是否有PCR產物存在。如果沒有PCR擴增產品，應使用引物設計軟件檢查引物的各種指標是否合適: Tm. 與模板的批配度、 二級結構、擴增片段的長度、非特異型擴增的情況。具體的數據請翻閱前面的相關原理說明
11.引物之間的Tm值相差過多：上下游引物的Tm值差不應超過4C。
12.引物或探針的使用濃度不合適：應將濃度控制在50- 900 nM之間，探針的濃度低于引物的濃度。
13.引物或探針降解：使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA模板是否降解，檢查DNA模板的儲存條件是否合適，如果確認降解應重新制備新鮮的DNA模板。
14.探針設計的位置在擴增片段的5’端：應將探針設計的位置靠近擴增片段的3”端
15.探針被氧化：避免用酸性溶液溶解探針，否則會產生高背景熒光信號及低的擴增信號。推薦的緩沖液是pH8.0的TE緩沖液中。