一、重金屬檢查法
重金屬系指在實驗條件下能與硫代乙酰胺或硫化鈉作用顯色的金屬雜質。如銀、鉛、汞、銅、鎘、鉍、錫、砷、銻、鎳、鈷鋅等。藥物中重金屬的存在影響藥物的穩定性及安全性。因生產中遇到鉛的機會較多,且鉛在體內又易積蓄中毒,故以鉛作為重金屬的代表。《中華人民共和國藥典》(2015)收載了重金屬檢查的三種方法。
1.第一法(硫代乙酰胺法)
本法用于溶于水、稀酸和乙醇的藥物。
(1)原理
硫代乙酰胺在弱酸性(pH3.5)條件下水解,產生硫化氫,與重金屬離子生成黃色到棕黑色的硫化物混懸液,與一定量標準鉛溶液經同法處理后所呈顏色比較,判斷供試品中重金屬是否符合限量規定。
(2)操作方法
除另有規定外,取25ml納氏比色管3支,甲管中加標準鉛溶液一定量與醋酸鹽緩沖液(pH3.5)2ml后,加水或各藥品項下規定的溶劑稀釋成25ml,乙管中加入按各藥品項下規定的方法制成的供試液25ml,丙管中加入與乙管相同量的供試品,加配制供試品溶液的溶劑適量使溶解,再加與甲管相同量的標準鉛溶液與醋酸鹽緩沖液(pH3.5)2ml后,用溶劑稀釋成25ml;若供試液帶顏色,可在甲管中滴加少量的稀焦糖溶液或其他無干擾的有色溶液,使之與乙管、丙管一致;再在甲、乙、丙三管中分別加硫代乙酰胺試液各2ml,搖勻,放置2min,同置白紙上,自上向下透視,當丙管中顯出的顏色不淺于甲管時,乙管中顯出的顏色與甲管比較,不得更深。如丙管中顯出的顏色淺于甲管,應取樣按第二法重新開始;如在甲管中滴加稀焦糖溶液或其他無干擾的有色溶液,仍不能使顏色一致時,應取樣按第二法檢查。
(3)測定條件
①標準鉛溶液的制備 稱取硝酸鉛0.1599g,置1000ml量瓶中,加硝酸5ml與水50ml溶解后,用水稀釋至刻度,搖勻,作為貯備液。精密量取貯備液10ml,置100ml量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,即得(每1ml相當于10μg的Pb)。本液僅供當日使用。配制與貯存用的玻璃容器均不得含鉛。
②在測定條件下,適宜目視比色的濃度范圍為每27ml溶液中含10～20μg的Pb2+,相當于標準鉛溶液1.0～2.0ml。
③檢查是在醋酸鹽緩沖溶液(pH3.5)2ml中進行。在pH3～3.5時,硫化鉛沉淀較完全。酸度增大,重金屬離子與硫化氫呈色變淺,酸度太大時甚至不顯色。
④供試品如含高鐵鹽影響重金屬檢查時,可在甲、乙、丙三管中分別加入相同量的維生素C 0.5～1.0g,再照上述方法檢查。配制供試品溶液時,如使用的鹽酸超過1.0ml,氨試液超過2ml,或加入其他試劑進行處理者,除另有規定外,甲管溶液應取同樣同量的試劑置瓷皿中蒸干后,加醋酸鹽緩沖液(pH=3.5)2ml與水15ml,微熱溶解后,移置納氏比色管中,加標準鉛溶液一定量,再用水或各種項下規定的溶劑稀釋成25ml。
2.第二法
適用于含芳環、雜環以及不溶于水、稀酸及乙醇的有機藥物
(1)原理
重金屬可與芳環、雜環形成較牢固的價健,可先熾灼破壞,所得殘渣加硝酸進一步破壞,蒸干。再加鹽酸轉化為易溶于水的氯化物,再按第一法檢查。
(2)操作方法
除另有規定外,必須改用第二法檢查時,取各項下規定量的供試品,按熾灼殘渣檢查法進行熾灼處理,然后取遺留的殘渣;或直接取熾灼殘渣項下遺留的殘渣;如供試品為溶液,則取各品種項下規定量的溶液,蒸發至干,再按上述方法處理后取遺留的殘渣;加硝酸0.5ml,蒸干,至氧化氮蒸氣除盡后(或取供試品一定量,緩緩熾灼至完全炭化,放冷,加0.5～1.0ml,使恰濕潤,用低溫加熱至硫酸除盡后,加硝酸0.5ml,蒸干,至氧化氮蒸氣除盡后,放冷,在500～600℃熾灼使完全灰化),放冷,加鹽酸2ml,置水浴上蒸干后加水15ml,滴加氨試液至對酚酞指示液顯微粉紅色,再加醋酸鹽緩沖液(pH3.5)2ml,微熱溶解后,移置納氏比色管中,加水稀釋成25ml,作為甲管;另取配制供試品溶液的試劑,置瓷皿中蒸干后,加醋酸鹽緩沖液(pH3.5)2ml與水15ml,微熱溶解后,移至納氏比色管中,加標準鉛溶液一定量,再用水稀釋成25ml,作為乙管;再在甲、乙兩管中分別加硫代乙酰胺試液各2ml,搖勻,放置2min,同置白紙上,自上向下透視,乙管中顯出的顏色與甲管比較,不得更深。
3.第三法
適用于溶于堿而不溶于稀酸或在稀酸中即生成沉淀的藥物。
(1)原理
在堿性介質中,以硫化鈉為顯色劑,Pb2+與S2-作用生成PbS微粒混懸液,與一定量標準鉛溶液經同法處理后所呈顏色比較。
(2)操作方法
除另有規定外,取供試品適量,加氫氧化鈉試液5ml與水20ml溶解后,置納氏比色管中,加硫化鈉試液5滴,搖勻,與一定量的標準鉛溶液同樣處理后的顏色比較,不得更深。
除另有規定外,取25ml納氏比色管3支,甲管中加標準鉛溶液一定量與醋酸鹽緩沖液(pH3.5)2ml后,加水或各藥品項下規定的溶劑稀釋成25ml,乙管中加入按各藥品項下規定的方法制成的供試液25ml,丙管中加入與乙管相同量的供試品,加配制供試品溶液的溶劑適量使溶解,再加與甲管相同量的標準鉛溶液與醋酸鹽緩沖液(pH3.5)2ml后,用溶劑稀釋成25ml;若供試液帶顏色,可在甲管中滴加少量的稀焦糖溶液或其他無干擾的有色溶液,使之與乙管、丙管一致;再在甲、乙、丙三管中分別加硫代乙酰胺試液各2ml,搖勻,放置2min,同置白紙上,自上向下透視,當丙管中顯出的顏色不淺于甲管時,乙管中顯出的顏色與甲管比較,不得更深。如丙管中顯出的顏色淺于甲管,應取樣按第二法重新開始檢查。如在甲管中滴加稀焦糖溶液或其他無干擾的有色溶液,仍不能使顏色一致時,應取樣按第二法檢查。
二、砷鹽檢查法
砷鹽多由藥物生產中使用的無機試劑及搪瓷反應器引入,砷為毒性雜質,須嚴格控制其量。
1.古蔡氏檢砷法
(1)原理
金屬鋅與酸作用產生新生態氫,將藥物中微量砷還原為砷化氫,當砷化氫氣體遇溴化汞紙時,根據含砷量不同產生黃色至棕色的砷斑,與同一條件下定量標準砷溶液所生成的砷比較判定供試品砷鹽是否符合限量規定。
(2)操作方法
①標準砷斑的制備 精密量取標準砷溶液2ml,置A瓶中,加鹽酸5ml與水21ml,再加碘化鉀試液5ml與酸性氯化亞錫試液5滴,在室溫放置10min后,加鋅粒2g,立即將照上法裝妥的導氣管密塞于A瓶上,并將A瓶置25~40℃水浴中,反應45min,取出溴化汞試紙,即得。
若供試品需經有機破壞后再行檢砷,則應取標準砷溶A液代替供試品,照該藥品種項下規定的方法同法處理后,依法制備標準砷斑。
②檢查法 于導氣管中裝入醋酸鉛棉花60mg(裝管高度為60～80mm),再于旋塞的頂端平面上放一片溴化汞試紙(試紙大小以能覆蓋孔徑而不露出平面外為宜),蓋上旋塞蓋并旋緊。取按各藥品項下規定方法制成的供試液,置A瓶中,照標準砷斑的制備,自“再加碘化鉀試液5ml”起,依法操作。將生成的砷斑與標準砷斑比較,不得更深。
(3)測定條件
①標準砷溶液的制備稱 取三氧化二砷0.132g,置1000ml量瓶中,加20%氫氧化鈉溶液5ml溶解后,用適量的稀硫酸中和,再加稀硫酸10ml,用水稀釋至刻度,搖勻,作為貯備液。臨用前,精密量取貯備液10ml,置1000ml量瓶中,加稀硫酸10ml,用水稀釋至刻度,搖勻,即得(每1ml相當于1μg的As)。
②標準砷斑應用2ml標準砷溶液制成。藥物含砷限量不同,可按規定限量改變供試品取用量,不可改變標準砷溶液取量。
③因為As5+生成砷化氫的速度慢,在反應液中加入還原劑酸性氯化亞錫及碘化鉀,將供試品中可能存在的As5+還原為As3+;氧化生成的碘又被氯化亞錫還原為碘離子,與反應中產生的鋅離子形成穩定的絡離子,使生成砷化氫的反應不斷進行。
④供試品及鋅粒中可能含有少量硫化物,在酸性條件下將產生硫化氫氣體。該氣體遇溴化汞試紙生成硫化汞色斑,產生假陽性,干擾試驗結果。采用醋酸鉛棉花,可預先吸收硫化氫,避免其與溴化汞試紙作用。醋酸鉛棉花用量太少,可能除不盡硫化氫,太多或塞得太緊會阻礙砷化氫的通過。所以藥典規定取醋酸鉛棉花60mg,裝管高度為60～80mm,這樣即使在1000μg硫存在下也不干擾測定。
(4)注意事項
①若供試品為硫化物、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等,在酸性溶液中生成硫化氫或二氧化硫氣體,與溴化汞作用生成黑色硫化汞或金屬汞,干擾比色。應先加硝酸處理,使氧化成無干擾的硫酸鹽,過量的硝酸及產生的含氮氧化物應蒸干除盡。
②供試品若為鐵鹽,不僅消耗還原劑,影響測定條件,且能氧化砷化氫。應該先加酸性氯化亞錫試液,將Fe3+還原為Fe2+,再依法檢查。
③供試品若為強氧化劑或在酸性溶液中能產生強氧化性物質者,如亞硝酸鈉在酸性溶液中能產生亞硝酸和硝酸,不僅消耗鋅粒且產生含氮的氧化物氧化新生態的氫,影響砷化氫的生成。因此,需加入硫酸先行分解后依法測定。
④具環狀結構的有機藥物,因砷可能以共價鍵與其結合,需進行有機破壞后再檢查,常用的有機破壞法有堿破壞法和酸破壞法。
若供式品需經有機破壞后再行檢砷,則制備標準砷斑時,應取標準砷溶液2.0ml代替供試品,照各品種項下規定的方法同法處理后,依法制備標準砷斑。
⑤砷斑遇光、熱及濕氣則褪色。如需保存可將砷斑在石蠟飽和的石油醚溶液中浸過晾干或避光置于干燥器內,也可將砷斑用濾紙包好夾在記錄本中保存。
2.二乙基二硫代氨基甲酸銀法(Ag-DDC)
該法不僅可用于限量檢查,也可用作微量砷鹽的含量測定。
(1)原理
金屬鋅與酸作用產生新生態氫,與微量砷鹽反應,生成具揮發性的砷化氫,砷化氫與二乙基二硫代氨基甲酸銀(Ag-DDC)作用,游離出銀,此膠態的銀呈紅色,與同條件下一定量標準砷溶液所產生的顏色比較,或在510nm波長處測定吸光度,以判斷砷鹽限量。
(2)操作方法
①標準砷對照液的制備 精密量取標準砷溶液5ml,加鹽酸5ml與水21ml,再加碘化鉀試液5ml與酸性氯化亞錫試液5滴,在室溫放置10min后,加鋅粒2g,立即將導氣管與A瓶密塞,使生成的砷化氫氣體導入另一D管中,并將A瓶置25～40℃水浴中反應45min,取出D管,添加氯仿至刻度,混勻,即得。
若供試品需經有機破壞后再行檢砷,則應取標準砷溶液代替供試品,照各藥品項下規定的方法同法處理后,依法制備標準砷對照液。
②檢查法 于導氣管中裝入醋酸鉛棉花60mg(裝管高度約80mm),并于D管中精密加入二乙基二硫代氨基甲酸銀試液5ml。取照各藥品項下規定方法制成的供試液置A瓶中,照標準砷對照液的制備,自“再加碘化鉀試液5ml”起,依法操作。將所得溶液與標準砷對照液同置白色背景上,從D管上方向下觀察、比較,所得溶液的顏色不得比標準砷對照液更深。必要時,可將所得溶液轉移至1cm吸收池中,用適宜的分光光度計或比色計在510nm波長處以二乙基二硫代氨基甲酸銀試液做空白,測定吸收度,與標準砷對照液按同法測得的吸收度比較,即得。
三、硫化物檢查法
硫化物為有毒物質。檢查原理:是利用硫化物與鹽酸作用產生硫化氫氣體,遇醋酸鉛試紙產生棕色的硫化鉛“硫斑”,與一定量標準硫化鈉溶液在相同條件下生成的硫斑比較,判斷供試品中硫化物是否符合限量規定。
儀器裝置同古蔡法檢砷裝置,但導氣管中不裝醋酸鉛棉花,溴化汞試紙改用醋酸鉛試紙。反應溫度為80～90℃水浴中加熱10min。
四、硒鹽檢查法
藥物中混入的微量硒主要來自生產中使用的試劑。元素狀態的硒無毒,但硒化物(二氧化物)有劇毒,因此對有可能引入硒的藥物要對殘留硒進行限量檢查。檢查時先將有機藥物用氧瓶燃燒法進行有機破壞,使硒成為高價氧化物(SeO3),被硝酸溶液吸收,再用鹽酸羥胺將Se6+還原為Se4+,在pH=2.0±2的條件下,加二氨基萘試液反應100min,生成4,5-苯并苯硒二唑,用環己烷提取后在378nm波長處測定吸光度,結果應不大于對照液的吸收度。