1.物理法
(1)臭味及揮發性差異
利用藥物中存在的雜質具有特殊臭味,判斷該雜質的存在。
例如:麻醉乙醚中檢查異臭,取本品10ml,置瓷蒸發器中,使自然揮發,揮散完畢后不得有異臭。
(2)顏色差異
利用某些藥物無色,而其分解產物有色,或從生產中引入了有色的有關物質,可通過檢查供試品溶液的顏色來控制其有色雜質的量。
例如:葡萄糖的顏色檢查,取本品5.0g,加熱水溶解后,放冷,用水稀釋至10ml,如顯色,與對照液1.0ml加水稀釋至10ml比較,不得更深。
(3)溶解行為差異
利用藥物和雜質溶解行為的差異進行檢查。
例如:葡萄糖中糊精的檢查,利用葡萄糖可溶于熱乙醇,而糊精溶解度小,檢查乙醇溶液的澄清度,規定取本品1.0g,加乙醇20ml,置水浴上加熱回流約40min,要求溶液應澄清。
(4)旋光法差異
藥物在制備過程中易引入光學異構體,利用它們旋光性質的差異,通過測定旋光度可以控制雜質的限量。例如:硫酸阿托品中莨菪堿的檢查,利用硫酸阿托品為消旋體,無旋光性,而莨菪堿為左旋體,規定供試品溶液(50mg/ml)的旋光度不得過-0.4°,以控制莨菪堿的量。
2.化學法
(1)顯色反應
利用雜質與一定試劑反應產生顏色進行檢查。
例如:鹽酸嗎啡中罌粟酸的檢查,利用罌粟酸在微酸性溶液中與三氯化鐵生成紅色罌粟酸鐵,規定取本品0.15g,加水5ml溶解后,加稀鹽酸5ml與三氯化鐵試液2滴,不得顯紅色。
(2)沉淀反應
利用雜質與一定試劑反應產生沉淀進行檢查。
例如:氯化鈉中鋇鹽的檢查,利用鋇離子與硫酸根離子生成沉淀,而藥物不干擾的特點,規定取本品4.0g,加水20ml溶解后,濾過,濾液分為兩等份,一份中加稀硫酸2ml,另一份中加水2ml,靜置15min,兩液應同樣澄清。
(3)氣體反應
利用雜質與一定試劑反應產生氣體進行檢查。
例如:氧化鎂中碳酸鹽的檢查,利用碳酸鹽加醋酸即生成醋酸鎂和二氧化碳的特性,規定取本品0.10g,加水5ml,煮沸,放冷,加醋酸5ml,不得泡沸。
(4)酸堿性的差異
利用藥物與雜質酸堿性的差異對藥物中的雜質進行檢查。
例如:維生素E的酸度檢查,取乙醇與乙醚各15ml,置錐形瓶中,加酚酞指示液0.5ml,滴加氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)至微顯粉紅色,加本品1.0g,溶解后,用氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)滴定,消耗的氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)不得過0.5ml。
(5)氧化還原性的差異
利用藥物與雜質的氧化性或還原性的差異對藥物中的雜質進行檢查。
例如:鹽酸嗎啡中阿撲嗎啡的檢查,利用阿撲嗎啡還原性強,其水溶液在碳酸氫鈉堿性條件下,經碘試液氧化,生成水溶性綠色化合物,此產物能溶于乙醚,乙醚層顯深寶石紅色,水層仍顯綠色的特點,規定取本品50mg,加水4ml溶解后,加碳酸氫鈉0.10g與0.1mol/L碘溶液1滴,加乙醚5ml,振搖提取,靜置分層后,乙醚層不得顯紅色,水層不得顯綠色。
3.光譜法
(1)紫外分光光度法
利用藥物與雜質紫外特征吸收的差異進行檢查。
例如:腎上腺素中酮體的檢查,利用酮體在310nm處有較強吸收,而腎上腺素在此波長處無吸收的特點。規定取本品加鹽酸(9→2000)制成每1ml中含2.0mg的溶液,照紫外可見分光光度法,在310nm波長處測定,吸光度不得過0.05。已知酮體在該波長處吸收系數()為453,通過計算可知控制酮體的限量為0.06%。再如兩性霉素B中兩性霉素A的檢查,利用兩性霉素A在305nm處吸收最強,而兩性霉素B在此波長處幾乎無吸收。規定取本品,加少量二甲基亞砜溶解后,加甲醇定量稀釋制成每1ml中含100μg的溶液,照紫外-可見分光光度法,在305nm波長處測定吸光度,不得過0.40。
(2)原子吸收分光光度法
原子吸收分光光度法是一種靈敏度高、專屬性強的測定方法,主要用于微量金屬元素的測定。通常采用標準加入法控制藥物中金屬雜質的限量:取供試品,按各品種項下的規定,制備供試品溶液;另取等量的供試品,加入限度量的待測元素溶液,制成對照品溶液。設對照溶液的讀數為a,供試品溶液的讀數為b,b值應小于(a-b)。
例如:碳酸鋰中鉀的檢查。取本品0.10g兩份,分別置50ml量瓶中,各加鹽酸溶液(1→2)10ml溶解后,一份中加水稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液;另一份中加標準氯化鉀溶液3.0ml,并用水稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液。照原子吸收分光光度法,在766.5nm波長處測定,應符合規定。
(3)紅外分光光度法
紅外分光光度法在雜質檢查中,主要用于藥物中無效或低效晶型的檢查。某些多晶型藥物由于晶型結構不同,某些化學鍵的鍵長、鍵角發生不同程度的變化,導致紅外吸收光譜中的某些特征帶的頻率、峰形和強度出現顯著差異。利用這些差異,可以檢查藥物中低效或無效晶型的檢查,結果可靠。
例如:甲苯咪唑中A晶型的檢查,甲苯咪唑有三種晶型,其中C晶型為有效晶型,在640cm-1吸收很弱,在662cm-1有強吸收,無效A晶型在這兩個波數處的吸收情況正好相反,故當供試品中含有A晶型時,在上述兩波數處的吸光度比值將發生變化。中國藥典采用供試品與含A晶型為10%的甲苯咪唑對照品同法操作,供試品在640cm-1與662cm-1波數處吸光度之比不得大于對照品在該波數處的吸光度之比的方法控制A晶型的量。
4.色譜法
(1)薄層色譜法
TLC具有簡便、快速、靈敏、不需特殊設備等優點,在雜質檢查中應用廣泛。有如下常用方法。
①雜質對照品法 適用于待檢雜質已經確定,并且具備該雜質的對照品的情況。
方法:根據雜質限量,取一定濃度已知雜質的對照品溶液和供試品溶液,分別點在同一薄層板上,展開,顯色定位,檢查,供試品溶液所顯雜質斑點與雜質對照溶液主斑點進行比較。
例如:異煙肼中游離肼的檢查,取本品,加溶劑制成每1ml中含100mg的溶液,作為供試品溶液,另取硫酸肼加溶劑制成每1ml中含0.08mg(相當于游離肼20μg)的溶液,作為對照品溶液,吸取上述溶液各5μl,分別點于同一硅膠G薄層板上,展開,晾干,顯色,檢視。在供試品溶液主斑點前方與對照品溶液主斑點相應的位置上,不得顯黃色斑點。
②供試品溶液自身稀釋對照法 適用于雜質不確定,或雜質已知但沒有雜質對照品的情況,該法僅限于雜質斑點顏色與主成分斑點顏色相同或相近的情況。
方法:將供試品溶液按限量要求稀釋成一定濃度作為對照溶液,將對照品溶液和供試品溶液分別點在同一薄層板上,展開,顯色定位,檢查,供試品溶液所顯雜質斑點與對照溶液主斑點進行比較,不得更深。
例如:布洛芬中有關物質檢查,取本品,加三氯甲烷制成每1ml中含100mg的溶液,作為供試品溶液;精密量取適量,用三氯甲烷定量稀釋制成每1ml中含1mg的溶液,作為對照溶液。照薄層色譜法試驗,吸取上述兩種溶液各5μl,分別點于同一硅膠G薄層板上,展開,晾干,顯色,檢視。供試品溶液如顯雜質斑點,與對照溶液的主斑點比較,不得更深。
③雜質對照品與供試品溶液自身稀釋對照并用法 適用于藥物中存在多個雜質時,其中已知雜質有對照品,采用雜質對照品法檢查,共存的未知雜質或沒有對照品的雜質,則同時采用供試品溶液自身稀釋對照法檢查。
④對照藥物法 適用于無雜質對照品,或者供試品的雜質斑點顏色與主成分斑點顏色有差異的情況。
方法:采用與供試品相同的藥物作為對照。對照藥物中所含待檢雜質需符合限量要求,穩定性好。
例如:馬來酸麥角新堿中有關物質檢查,取供試品,精密稱定,加乙醇-濃氨溶液(9:1)溶解并定量稀釋制成每1ml中含5mg的溶液與每1ml中含0.2mg的溶液,分別作為供試品溶液A和B,另取馬來酸麥角新堿對照品,精密稱定,用上述溶劑溶解并定量稀釋制成每1ml中含5mg的溶液,作為對照品溶液C,照薄層色譜法試驗,吸取上述三種溶液各10μl,分別點于硅膠G薄層板上,展開,晾干檢視,溶液A主斑點的位置和顏色應與溶液C的主斑點相同,所顯雜質斑點,其顏色不得深于溶液C對應的雜質斑點,并不得有溶液C以外的雜質斑點;溶液B除主斑點外,不得顯任何雜質斑點。
(2)高效液相色譜法(HPLC)
HPLC具有分離效能高、專屬性強、靈敏度高、可以準確測定各組分的峰面積等優點,在雜質檢查中應用日益增多。有如下常用方法。
①外標法 適用于有雜質的對照品,進樣量能精確控制的情況。
方法:配制雜質對照品溶液和供試品溶液,分別取一定量注入色譜儀,測定雜質對照品和供試品溶液中雜質峰的響應,按外標法計算雜質限量。
例如:阿司匹林中水楊酸的檢查,精密量取供試品溶液、對照品溶液各10μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如顯水楊酸色譜峰,按外標法以峰面積計算供試品中水楊酸含量,含水楊酸不得過0.1%。
②不加校正因子的主成分自身對照法 適用于沒有雜質的對照品的情況。
方法:將供試品溶液稀釋配制對照溶液并調節儀器靈敏度后,取供試品溶液和對照溶液適量,分別進樣,前者的記錄時間除另有規定外,應為主成分色譜峰保留時間的2倍,測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積,并與對照溶液主成分的峰面積比較,計算雜質含量。
例如:利巴韋林中有關物質的檢查,取本品,加流動相溶解并制成每1ml中約含0.4mg的溶液作為供試品溶液,精密量取1ml,置100ml量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液。照含量測定項下的色譜條件精密量取供試品溶液與對照溶液各20μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。供試品溶液的色譜圖中如有雜質峰,單個雜質的峰面積不得大于對照溶液主峰面積的0.25倍(0.25%),各雜質峰面積的和不得大對照溶液的主峰面積(1.0%)。
③加校正因子的主成分自身對照法 適用于已知雜質的情況,本法優點是既省去了雜質對照品,又考慮到了雜質與主成分響應因子的不同所引起的測定誤差,準確度好。
方法:將供試品溶液稀釋成和規定中限度相當的溶液作為對照溶液,取供試品溶液和對照溶液適量,分別進樣,記錄色譜圖。測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積,分別乘以相應的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較,依法計算各雜質含量。
例如:紅霉素A中紅霉素B、C組分的檢查,取本品,用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)-甲醇(15:1)溶解并稀釋制成每1ml中約含4mg的溶液,作為供試品溶液;精密量取5ml,置100ml量瓶中,用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)-甲醇(15:1)稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液。照紅霉素A組分項下的色譜條件,精密量取供試品溶液與對照溶液各20μl,分別注人液相色譜儀,記錄色譜圖。紅霉素B按校正后的峰面積計算(乘以校正因子0.7)和紅霉素C峰面積均不得大于對照溶液主峰面積(5.0%)。
④面積歸一化法 只適用于供試品中結構相似、相對含量較高且限度范圍較寬的雜質含量的粗略考查。
方法:取供試品溶液進樣,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖。測定各雜質及藥物的峰面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積,計算各雜質峰面積及其總和占總峰面積的百分率,不得超過限量。
例如:頭孢呋辛酯中異構體的檢查,在含量測定項下記錄的供試品溶液色譜圖中,頭孢呋辛酯A異構體峰面積與頭孢呋辛酯A、B異構體峰面積和之比應為0.48～0.55。
(3)氣相色譜法
GC用于藥物中揮發性特殊雜質的檢查。常用的檢查方法與HPLC類似。
例如:樟腦中有關物質的檢查,取本品適量,加正庚烷溶解并稀釋成濃度約為100mg/ml和1mg/ml的溶液,分別作為供試品溶液和對照溶液;另取3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇與乙酸龍腦酯各適量,加正庚烷溶解并稀釋制成每1ml中各約含0.5mg的混合溶液,作為系統適用性試驗溶液。按照氣相色譜法試驗,以聚乙二醇20M(或極性相近)為固定液,FID檢測,各進樣1μl,注入氣相色譜儀,3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇峰與乙酸龍腦酯峰之間的分離度應大于2.0;用對照溶液調節檢測靈敏度,使主成分峰高約為滿量程的20%;供試品溶液如有雜質峰,單個雜質峰面積不得大于對照溶液主峰面積的2倍(2.0%),各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的4倍(4.0%)。