分析方法的開發主要包括色譜柱的選擇、流動相的選擇、檢測波長的選擇和梯度的優化幾個方面。目前高效液相色譜法（HPLC)多使用反相色譜法，本文主要以反相為例講解。
1.液相色譜柱的選擇
原料藥生產對產品的純度和雜質含量的要求非常苛刻，要求檢測使用的色譜柱有較高的理論塔板數，能提供更好的分離度，從而對可能存在的雜質有更大的分離的可能性，所以5um填料的色譜柱長要250mm，3.5um填料的柱長要150mm，基本上都是各個粒徑柱長最長的。喜歡近兩年新出的亞二微米填料的色譜柱，50mm柱長就能提供很高的理論塔板數，而且柱長和粒徑小了，流速增加很多，能節省很多的分析時間，極大的提高工作效率。一般選用直徑為4.6mm或3.0mm的柱子，太細了可能會增大柱外效應。填料的孔徑對于小分子合成藥物不需要考慮，普通的分析柱都在100A左右，能滿足分析檢測的需要。對于API分析方法開發，一般要求必須做色譜柱的篩選實驗，最少使用三種不同類型的色譜柱，每種類型三只，要來自于不同廠家。
三種類型包括：1)普通的C18或相應的C8色譜柱，如Waters的Symmetry C18或C8，YMC的Pack Pro C18或C8，Agilent的RX C8等，其它公司如菲羅門和熱電也有相應的色譜柱；2)封端處理的或者極性嵌入型色譜柱，如Waters的Symmetry Shield RP18或RP8，XTerraRP18或RP8，YMC的ODS AQ，Agilent的Zorbax SB AQ等，其它公司如菲羅門和熱電也有相應的色譜柱；3)填料用其它官能團修飾過的色譜柱，如氨基柱、氰基柱、苯基柱等。一般不同類型的色譜柱在選擇性上會有很大的差異，相同類型的色譜柱生產廠家不同在選擇性上也會有差異，這個主要是填料的性質和生產工藝決定的，有時候用一只色譜柱分離不好，除了優化梯度和流動相外，換一個廠家的柱子也是一個很好的選擇。相同品牌型號的色譜柱，C18和C8在選擇性上沒有差異，但是C18保留能力更強，相同的樣品分離度更高，我們一般傾向于選擇用C18。我們在篩選色譜柱時盡量選擇行業內排名前幾位的廠家，柱子品質好，開發分析方法時能省很多力氣，做出來的分析方法也有保證。一個藥從開發到上市可能會持續十幾年甚至更長時間，廠家有實力，開發方法時選定的柱子在若干年以后需要時還會有的買，做分析時重復性也能保障。多用幾只色譜柱做篩選和分析方法優化，能盡最大的可能提高分析方法的質量，保證檢測結果的可信度。常用的柱子有：Agilent的Zorbax Eclipse XDB-C18、Zorbax Eclipse Plus C18，Waters的Symmetry C18、XTerra RP18、XTerra MS C18等，YMC的柱子有時會是不錯的備用選擇，菲羅門的柱子菲羅門的柱子國內外市場占有率較高，但是感覺柱子壓力高，壽命短，盡量不用，熱電的柱子用的也不少，但沒什么感覺。制劑分析方法選擇色譜柱的要求基本和API相一樣，對于中間體和生產過程中反應跟蹤（IPC）分析方法開發使用的色譜柱，一般會根據樣品性質直接選取一兩只普通C18或者封端處理過的色譜柱，簡化篩選過程。
2.流動相的選擇
常用做反相流動相的溶劑是甲醇和乙腈，甲醇有其性價比的優勢，但是甲醇活性高，可能與某些樣品發生反應，而且甲醇在低波長下有紫外吸收，會降低分析方法的靈敏度；乙腈雖然價格很高，毒性比甲醇大，但是洗脫能力比甲醇強，很少與樣品發生反應，用作流動相系統壓力要比甲醇低很多，且截止波長比甲醇低20nm，增加了檢測出在低波長下才有吸收的雜質的可能性，所以我們一般傾向于多用乙腈，少用甲醇。但是有時候樣品峰形不好或者分離不好，更換溶劑試試是一個很好的選擇，畢竟不同的溶劑提供不同的選擇性。流動相的優化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加堿、加鹽，從而改善峰形、提高分離度。流動相里加堿的情況比較少，主要還是加酸，常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸和三氟乙酸，磷酸在低波長下沒有紫外吸收，而三氟乙酸在低波長下有，但是三氟乙酸易揮發而磷酸不行，所以單純做液相，低波長下磷酸最合適，三氟乙酸有吸收，運行梯度時基線漂移很嚴重，而做液質就要考慮首選三氟乙酸了，近些年還比較流行加甲酸或乙酸。一般情況下這幾種酸沒有太大區別，我們更多的是考慮通過加酸改變流動相的pH值，從而改善樣品的分離度和峰形。
1)流動相pH值改變可以改變樣品的保留時間和分離度；
2)流動相pH值改變甚至可以改變某些樣品出峰的先后順序；
3)流動相pH值改變可以改變樣品的峰高，即可以調整峰形。
相同進樣量樣品峰越高則意味著峰形越好，看出多數樣品在低pH值下峰形都比中性要好，這個主要是由色譜柱本身的性質所決定的。色譜柱主要都是硅膠基質，現有的填料處理工藝無法將硅膠上殘余的硅羥基全部去除，硅羥基會造成樣品峰拖尾，一般認為硅羥基的pKa在3.5到4.5之間，低pH值能幫助抑制硅羥基的活性，減小拖尾，從而改善峰形，提高分離度。水溶液中添加0.1%（體積）的磷酸或者三氟乙酸其pH值大概在2左右，用作流動相正好抑制硅羥基的活性，所以開發液相分析方法時流動相首選水加01.%的磷酸，然后再以此為基礎做優化。在單獨用酸不行的時候就要考慮使用緩沖鹽，緩沖鹽的選擇原則是：簡單、穩定、緩沖能力強、配制簡單，需要調pH值時要有相應的酸或堿。常用的緩沖鹽是磷酸鹽，主要是鉀鹽和鈉鹽，再有就是醋酸鹽，常用的鹽濃度在10~20mM左右。以前因為色譜柱填料生產工藝的問題，往往需要在流動相里添加三乙胺來減少拖尾，但是三乙胺對色譜柱的壽命有很大影響，現在新的色譜柱都不再需要了。流動相里有時會需要調節pH值到堿性，具體pH要視色譜柱的耐受范圍而定，常用NaOH、KOH溶液或氨水做為調節緩沖鹽溶液堿性pH的試劑，也可以往水里單獨添加氨水做堿性流動相。在緩沖鹽做流動相時，出峰太早、峰形很差、相似結構的化合物峰因為拖尾或峰型太寬而不能達到基線分離時，可以考慮使用離子對試劑，常用的離子對試劑主要是各種烷基磺酸鈉和四丁基銨鹽，但是流動相里使用離子對試劑時，系統需要的平衡時間長，樣品保留時間不是很穩定，因為離子對試劑的背景吸收基線會很差，且做完樣品后需要長時間清洗，所以我們盡量不使用離子對試劑。使用緩沖鹽時要注意流動相混合以后鹽可能析出的問題和鹽背景吸收導致基線漂移嚴重的問題，尤其是在流動相里添加醋酸銨以后，在低波長下梯度變化時基線下降非常嚴重，嚴重影響對含量較小雜質的準確定量，可以考慮在乙腈里加入10%的水，水中預先加入10倍水溶液濃度的緩沖鹽，這樣梯度中A、B兩項鹽的濃度相同，可以避免基線漂移嚴重的問題。原料藥一般結構式比較大，分子構成比較復雜，開發分析方法時用水加磷酸效果可能效果不好，通常還要求最少嘗試2和6.5兩個pH值的磷酸鹽緩沖溶液，并依據結果對流動相進行pH優化，如效果不理想再進一步嘗試其它緩沖鹽溶液。開發中間體或者IPC的分析方法時可以根據經驗酌情簡化流動相的選擇過程
3.梯度的優化
梯度優化主要是通過調節流動相的起始比例和梯度的斜率來調整樣品的保留時間，優化樣品的分離度。有機相起始比例越小，樣品保留時間越長，隨著梯度的改變，樣品出峰的先后順序也有可能改變。我們做梯度優化時主要調整梯度的起始比例和斜率。現在的色譜柱或者采用了新的封端工藝，或者內嵌極性基團，耐水的能力都比較高。在酸性條件下很多化合物都以離子形式存在，極性較大，為了提高樣品的分離度，盡量使用大比例的水做梯度的起始。對于添加緩沖鹽的流動相要注意梯度變化過程中流動相組成改變時不能有鹽析出。對于水加0.1%磷酸的流動相，開始時可以采用95%的水做起始，以95%的有機相結束，注意根據實際情況在梯度最后用大比例的有機相沖洗幾分鐘，以保證把小極性的雜質洗脫下來，防止樣品殘留到下一針。梯度的斜率一般采用凹線型的先小后大，梯度變化先慢后快，在此基礎上再對梯度進行優化。使用緩沖鹽溶液的梯度水相起始比例一般要從10~20%開始，為了防止鹽析出，在梯度最后避免用純的有機相做沖洗，梯度斜率采用恒定的就可以，在此基礎上根據方法運行的情況對梯度進行調整。一般一個API的樣品采集的時間控制在40~50分鐘左右，樣品出峰在15~20分鐘左右比較好，如果有極性非常小的雜質存在可以在最后加一段時間的大比例有機溶劑沖洗色譜柱，最后再設置10分鐘左右的重新平衡時間。中間體和IPC的樣品分析方法時間可以根據需要減半或者時間更短。
4.波長的選擇
做分析方法開發需要二極管陣列檢測器，做色譜峰純度檢查和選擇檢測波長，通過色譜峰純度檢查來保證主峰里沒有掩蓋其它雜質，做純度檢測對波長選擇的要求比較簡單，原則是把盡量多的雜質在色譜圖上體現出來。很多雜質只有在低波長下才有紫外吸收，所以我們選擇盡可能低的波長，乙腈的截止波長在190~195nm，用乙腈做流動相檢測波長可以選擇在210~220nm。也有公司要求分別選取產品紫外吸收最強的波段和210~220nm兩個波段做對比，哪個純度低以哪個為準，這樣可以更嚴格的控制產品的質量。
液相色譜柱pH值使用范圍
樣品經過處理后得到的溶劑酸性較強，pH最低可達到低于1，進樣量設置為5μl，流動相用的是百分之0.2磷酸，長期使用會不會對柱子有損傷啊？
柱子是雙封端的C18柱，耐受pH在2——9，長期使用柱子是否會塌陷啊?另外有沒有什么好方法可以避免酸性這么強啊，求大神指點
解答：其實控制在2-8的pH值范圍內保險些 強極性的有機酸、有機堿如果要用HPLC來測，可以試試離子對色譜法，用于陰離子分離的對離子是烷基銨類，用于陽離子的對離子是烷基磺酸類 原理可以去查儀器分析書，具體怎么操作那就得查文獻了 如果樣品穩定，可以把ph調到色譜柱的耐受范圍內；或者使用ph范圍更寬的色譜柱，比如有機硅膠雜化顆粒的柱子；如果走的是梯度的話，使用保護柱也會相應延長色譜柱壽命的。
