藥物基因組學發展和應用（三）

 藥物基因組學為臨床醫生和臨床藥師提供了很大程度上改善幾百萬患者藥物治療效果的機會。但是，這個機會的利用卻受到阻礙和挑戰，并且新的知識還在不斷的更新。

    藥物轉運體的基因多態性

    藥物的生物利用度不僅取決于藥物代謝酶的活性，在較大程度上也有賴于生物膜上轉運體的活性。轉運體分布在許多屏障組織如腸道、肝臟、血腦屏障、腎臟、胎盤、睪丸和淋巴細胞等的頂膜上，因此對血漿、組織液，甚至細胞內藥物的分布都發揮著一定的作用。由于轉運體的分布和功能表現出非常大的變異性，推測膜轉運體基因的遺傳變異可以解釋一部分藥物藥代動力學和臨床療效上的個體差異。 根據不斷增加的轉運體成員，人類基因命名委員會對轉運體作了標準化命名，分為兩大類：ATP-結合盒轉運體（ATP-binding cassette transporters,ABC轉運體）和溶質載體（solute carrier,SLC）超家族。

    一、ABC轉運體

    大部分外排性轉運體屬于ABC轉運體超家族成員，可以影響多種細胞和組織內化合物的濃度。這些轉運體在阻止外源性物質的侵入中發揮了主要的屏障作用。底物跨膜轉運的能量來自ATP的水解和轉運體中間物的磷酸化，使底物能夠逆濃度梯度進行主動轉運。人類ABC轉運體共有49個成員，分為7個超家族(ABCA～ABCG)。ABC轉運蛋白的核心結構通常由4個結構域組成，包括2個高度疏水的跨膜結構域（transmembrane domain,TMD）和2個核苷酸結合域（nucleotide-binding domain, NBD）。每一跨膜結構域一般由6個?螺旋構成，也存在由10個、17個、19個?螺旋組成的跨膜結構域。它們形成一個跨膜通道以實現底物分子的跨膜運輸，同時還參與底物的識別過程。核苷酸結合域位于胞質，結合和水解ATP。

    （一）ABCB1

    編碼ABCB1的基因位于染色體7q21.12，編碼含有1280個氨基酸的多藥耐藥蛋白1(multidrug resistant 1,MDR1)，在許多組織細胞中廣泛表達。由于其結構中含有一個糖基，習慣上將其稱為P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp)。 P-gp是首個在人類組織中發現的ABC轉運體,也是最為

    重要的MDR介導因子。 P-gp除了在腫瘤細胞有分布外，在人體正常組織肝臟、腎臟、腸道、胎盤、血腦屏障、血睪屏障以及淋巴細胞系和心臟內小動脈、毛細血管等部位都有分布。P－gp主要位于這些細胞的絨毛面的一側（頂側），利用ATP水解釋放的能量，將作用底物從細胞內轉運至細胞外。這種對藥物的逆向轉運功能使得P-gp在藥物的吸收、分布、代謝和清除方面具有重要意義。P-gp的作用底物范圍非常廣泛，主要轉運疏水性的陽離子化合物。

    ABCB1上目前為止發現的SNP有數百個，最早對SNPs進行的系統研究發現第26外顯子上的沉 默突變3435C>T與腸道P-gp的表達水平和地高辛的生物利用度的改變有相關性，3435TT突變純合子攜帶者腸道P-gp的表達水平明顯下降，地高辛血漿水平顯著提高。隨后的研究發現第21外顯子2677G>T/A的突變可以導致893位氨基酸的改變，并且2677G>T/A 和 3435C>T存在連鎖不平衡關系。3435C>T的發生頻率存在顯著的種族差異，3435T等位基因的發生頻率在非裔黑種人中為17％－27％，亞洲人中為41％～47％，白種人中為52％～57％。ABCB1基因變異的功能意義目前還存在爭議，許多研究發現3435T的變異會引起功能喪失，而另一些研究則不這樣認為。3435C>T是如何影響 P-gp表達的，目前機制還不是很清楚。

    （二）ABCC2

    ABCC2又名多藥耐藥相關蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2,MRP2）,或小管多種有機陰離子轉運體（canalicular multispecific organic anion transporter,cMOAT）,屬于ABC轉運體C亞家族中的一員。ABCC2主要分布于肝細胞的管腔（頂）膜和腎近端小管細胞的管腔膜側，少部分位于腸道、膽囊上皮細胞、胚胎以及血腦屏障的內皮細胞等極性細胞的頂膜。 ABCC2基因位于10q24，共有32個外顯子,其編碼產生的蛋白由1545個氨基酸組成，含有17個跨膜螺旋結構，構成了3個跨膜結構域。ABCC2主動轉運陰離子藥物結合物，如葡糖醛酸鹽類、硫酸鹽類和谷胱甘肽結合物類，另外也可轉運許多非結合類物質，被認為是解毒路徑的重要一部分，見表5-3。此外，ABCC2也有助于抗癌藥物如順鉑、長春堿、喜樹堿衍生物等的轉運。最近推測認為ABCC2可能參與了霉酚酸和環孢素之間的相互作用。 以前的研究發現常染色體隱性遺傳疾病Dubin-Johnson 綜合征(DJS)與肝臟內ABCC2的缺失有關，引起高膽紅素血癥。研究發現DJS患者ABCC2基因上核苷酸的置換可以影響MRP2的表達或功能。除了能引起DJS的一些突變外，最近ABCC2基因上發現了許多不引起DJS的SNPs，在不同種族的正常人群中發現了40多個SNP。考慮到MRP2在排泄過程中的重要性，推測認為這些多態性有可能引起轉運和排泄活性的個體差異。 ABCC2最常見的基因多態性位點是5′端上游的?24C>T，第10外顯子的1249G>A (V417I)和第28外顯子的沉默突變3972C>T。其它非同義突變2302C>T (Ala768Trp)、 2366C>T(Ser789Phe)、4348G>A (Ala1450Thr)的發生頻率比較低。其中2302C>T在DJS患者中也有發現。由于突變位點2302C>T、2366C>T和 4348G>A位于ATP結合位點附近，其潛在的功能影響還未被證實。

    （三）ABCG2

    ABCG2, 也就是所謂的BCRP（Breast cancer-related protein,乳腺癌相關蛋白）或米托蒽醌耐藥蛋白，是ABC轉運體中G亞家族的一個成員。ABCG2基因位于4q22，編碼生成655個氨基酸的蛋白，分子量為72 kDa。ABCG2含有一個ATP結合域和一個跨膜區域，被稱為半個轉運體。在人體正常組織中，ABCG2主要表達于胎盤、結腸、小腸和肝臟。

    ABCG2基因上報道的序列變異目前有80多個，對8個影響BCRP轉運活性的非同義突變研究的比較多，其中5個是導致功能失活的：623T>C(Phe208Ser)不在膜上，使BCRP表達降低；742T>C (Ser248Pro)和1322G>A (Set441Asn)位于蛋白的胞內域；376C>T (Gln126X)和1000G>T( Glu334X)導致編碼提前終止，產生無活性的蛋白。另外兩個突變位點34G>A (Val12Met)和421C>A (Gln141Lys)表現為蛋白功能的下降。34G>A影響到BCRP蛋白在Lewis肺癌細胞血漿側膜上的定位，而421C>A與BCRP蛋白表達降低、ATP酶活性下降有關。421C>A突變等位基因的發生頻率存在種族差異，在亞洲人中的發生頻率是35％，考慮到其突變的高發生率，以及BCRP的組織分布和亞細胞內定位，有助于一定程度上解釋基因變異對于核苷衍生物分布的影響。最后，1291T>C(Phe431Leu)變異對轉運蛋白活性的影響表現為中等程度，其表現為不能轉運抗癌藥物甲氨蝶呤，但能夠介導內源性底物血卟啉的泵出，由此也證明基因變異的影響也具有底物特異性和選擇性。

    二、SLC超家族

    SLC超家族的大部分成員為攝取性轉運體（uptake transporters）,有助于化合物進入細胞內，尤其是營養物質和維生素；也有助于內源性物質如葡萄糖和其它小分子碳水化合物、氨基酸、短肽和核苷酸的攝取及膽汁酸的重吸收。SLC轉運體本身不能水解ATP提供能量，其轉運的驅動力來自原發性主動轉運系統產生的電化學梯度，而進行繼發性或三次主動轉運；或在細胞膜內外的底物濃度差或電位差的驅動下，介導底物的易化擴散。

    （一）有機陰離子轉運肽

    有機陰離子轉運肽（organic anion-transporting polypeptides，OATPs）是SLC21的基因產物。OATP1A2是第一個被報道人類OATP家族成員，隨后又發現了OATP1B1，現在人類OATP家族已經發現有11個成員，其中10個OATPs和一個前列腺素轉運體OATP2A1(PGT)。這些OATPs廣泛分布在與藥物吸收和處置密切相關的器官組織，如肝臟、腎臟、小腸、腦和胎盤。由于廣泛的組織分布及底物的選擇性，可使多種藥物吸收和處置的多個環節上發生相互作用。 OATPs可轉運的底物種類非常廣泛，OATP1A2可轉運許多有機陰離子，包括膽鹽、結合型和非結合型甾體激素、甲狀腺激素，甚至一些小分子的陽離子如N –甲基-奎尼丁。另外許多藥物，如非索非那定、δ啡肽II也被鑒定為OATP2的底物。OATP1B1在轉運內源性膽鹽、激素和膽紅素上和OATP1A2有重疊，此外OATP1B1還能轉運許多種類不同的藥物，包括HMG-CoA還原酶抑制劑普伐他汀、匹伐他汀、羅蘇伐他汀、阿托伐他汀，抗生素類利福平等。OATP1B3和OATP1B1的氨基酸序列有80％的同源性，底物范圍也比較相似，此外，OATP1B3還可轉運抗腫瘤藥物甲氨蝶呤和紫杉醇。 OATP1B1是一個高度變異基因，其產物主要表達于肝細胞基底膜上。人群中已發現其44個突 變位點，其中17個為外顯子非同義突變，4個為同義突變，20個位于內含子，其余3個位于基因啟動子區。非同義突變中有7個為高頻變異，在不同人群中它們的頻率具有較大的差異。388A>G(Asn130Asp)和521T>C(Val174Ala)在非裔美國人中的頻率分別為74％和1％ ，亞洲人為63％和16％ ，高加索人為40％和14％ ；388A>G和521T>C分別被命名為OATP1B1*1b（388G/521T）和OATP1B1*5(388A/521C)突變，兩種突變合稱OATP1B1*15(388G/521C)，野生型的則稱 OATP1B1*1a(388A/521T)。452A>G(Asn151Ser)僅在亞洲人中有發現，頻率為3.8％； 463C>A(Pro155Thr)和1929A>C(Leu643Phe)則僅在高加索人中有報道，頻率分別為8％和9％ ；1463G>C(Gly488Ala)和2000A>G(Glu667Gly)則只在非裔美國人中有報道，頻率分別為9％和34％。細胞水平和相關的臨床研究顯示，388A>G，521T>C，1463G>C和2000A>G等突變不同程度地降低了OATP1B1的轉運活性。體內研究證實，OATP1B1的基因突變可影響多種藥物的體內處置和排泄，普伐他汀非腎清除率在OATP1B1*5和*15突變個體中較OATP1B1*1a野生型純合子個體明顯下降，而*1b等位基因則可加快該藥物的分布和代謝。除普法他汀外，這兩個多態基因位點對羅蘇伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀藥動學也有類似的影響，而且相關研究提示，它們還可能是臨床他汀類藥物治療中相關橫紋肌溶解不良反應易感性的遺傳因素。

    在肝臟組織表達的OATPs中，除了OATP1B1外還有OATP2B1和OATP1B3。目前對后兩者參與藥物轉運情況研究相對較少。已有報道表明OATP2B1外顯子區具有高頻多態變異1457C>T(Phe486Ser)及1175C>T(Thr392Ile)。1457C>T在日本人中的發生頻率是30.9％，與雌酮-3-硫酸鹽轉運Vmax的降低有相關性。在高加索人群中發現了OATP1B3的3個非同義突變：334T>G(Ser112Ala)，699G>A(Met233Ile)、1564G>T(Gly522Cys)，頻率分別為78％、71％和2％ 。比較它們的功能時發現，攜帶334G和699A等位基因的OATP2B1具有相同的磺溴酞鈉與膽汁酸的轉運能力，而1564T突變則使之完全喪失磺溴酞鈉的轉運活性。值得關注的是，OATP1B3是唯一轉運強心苷類地高辛和膽囊收縮素到肝細胞內的OATP轉運體，因此基因變異對于OATP1B3特異性底物體內轉運的影響值得進一步的研究。SLCO1B3基因的轉錄調控因子法尼醇X受體（farnesoid X receptor，FXR）可以改變OATP1B3的表達水平，體外研究發現與肝臟內野生型純合子FXR*1A 相比，FXR*1B（SNP -1G>T）雜合子個體可降低OATP1B3的mRNA表達水平。 OATP1A2是OATP超家族中另一個受到關注的藥物轉運體。由于該轉運體主要分布于大腦毛細血管內皮細胞，成為一些物質進入中樞神經組織的通道，對中樞組織藥物濃度大小及效應具有重要影響。在一些人群的基因序列對比研究結果表明，OATP1A2相對變異程度小，但仍然存在一些多態變異位點。在非裔美國人中，先后發現404A>T(Asn135lle)、516A>C(Glu172Asp)以及2003C>G(Thr668Ser)，其頻率分別為11％，5％和4％。體外研究提示516C、404T和2003G為活性低下的OATP1A2等位基因，它們可能是一些中樞作用的藥物效應或不良反應個體差異的重要原因。

    （二）有機陰離子轉運體

    有機陰離子轉運體（organic anion transporter,OAT）是SLC22基因家族產物，能夠轉運具有各種不同化學結構的有機陰離子，包括多種內源性物質如馬尿酸鹽、尿酸、環核苷酸和前列腺素等及一系列外源性化學物。目前，OAT主要成員如OAT1，OAT2，OAT3，OAT4，OAT5，OAT6，尿酸轉運蛋白1(urate transporter1，URAT1)等的基因，均已從不同的種屬中克隆得到 。其中，OAT1和OAT3是主要分布在腎臟和腦；OAT2主要分布在肝臟；OAT4主要分布在胎盤和腎臟。 研究發現，OAT抑制劑如丙磺舒和西司他丁等，與β-內酰胺類抗生素合用時，可延長這些抗生素在血液中清除的半衰期并減少腎毒性的發生 。這一現象表明，一種或多種OAT可能介導了β-內酰胺類抗生素在腎小管上皮細胞中的蓄積。后來有研究表明，3種主要的β-內酰胺類抗生素青霉素G、頭孢噻啶和亞胺培南等均可由人OAT1，OAT2，OAT3以及OAT4所特異性轉運，而且這種轉運可被OAT抑制劑所抑制。有研究表明，OAT在其他一些具有腎毒性的藥物或環境毒物如甲氨蝶呤、非甾體類抗炎藥和赭曲霉素A等所引起的毒性反應中也起著重要作用。

    OAT1的編碼基因為SLC22A6,幾個重要的SNPs呈現種族差異性。非同義突變20T>C(Leu7Pro)、311C>T(Pro104Leu)、767C>T(Ala256Val)、877C>T(Arg293Trp)、1316G>A(Arg454Gln)和1575A>T(Lys525Ile)只在非裔人群中有發現。編碼生成OAT3的基因SLC22A8編碼區至少發現有12個非同義SNPs，在日本人的研究中發現,與野生型蛋白比較，1166C>T(A389V)變異等位基因攜帶者普伐他汀的清除率有些微的差異。在亞裔中Ile305Phe位點的突變率>3.5% ，這種突變降低了OAT3對底物的轉運，并在一定程度上改變了0AT3底物的特異性，多種藥物如西米替丁的代謝排泄也隨之發生改變。其它發現能夠改變雌酮-3-硫酸鹽和西米替丁轉運的SNPs還有445C>A(Arg149Ser)、779T>G(Ile260Arg)和715C>T(Gln239STOP)。

    （三）有機陽離子轉運體

    有機陽離子轉運體(organic cation transporter,OCT)屬于SLC超家族的重要一員，主要分為3個亞類，為OCT1、OCT2 和OCT3。 OCT1主要分布于肝細胞基底膜上, OCT2 主要分布于腎小管上皮細胞的外側基底膜上, OCT3 的組織分布較為廣泛,包括腦、心臟、骨骼肌、血管、肝臟和胎盤等組織。 OCTs在人體內主要負責轉運一些在生理pH環境中呈現陽離子狀態、且相對分子量不大的內外源性物質。OCT1在將藥物等內、外源性物質由肝血竇轉運進入肝細胞內的這一過程中起到關鍵作用。經由OCT1轉運的內、外源性物質有很多,常見的內源性物質包括皮質酮、雌二醇、前列腺素E2等；經其轉運的常見藥物包括組胺受體拮抗劑西米替丁、雷尼替丁和法莫替丁,雙胍類降糖藥二甲雙胍和苯乙雙胍,抗病毒藥物阿昔洛韋和更昔洛韋,帕金森治療藥物美金剛等。此外,還有一部分藥物不經OCT1 轉運,但對其有抑制效應,最具代表性的是非甾體類抗炎藥吲哚美辛、雙氯酚酸和匹羅希康。 

    OCT1的編碼基因為SLC22A1, 位于染色體6q26。OCT1的多個SNPs的等位基因頻率存在種族差異,181C>T(Arg61Cys)、262T>C(Cys88Arg)和17857G>A(Gly401Ser)3種SNPs僅在白種人中發現，頻率分別為9.10％，0.60％ 及3.20％,而848C>T(Pro283Leu)和964C>G(Arg287Gly)尚未在白種人中發現,848C>T(Pro283Leu) 在韓國人和中國人中的突變發生頻率分別為1.3%和0.5% 。以1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)和四乙胺（TEA）為底物來檢測OCT1 SNPs對其轉運活性的影響，發現攜帶有848C>T(Pro283Leu)和859C>G(R287G)的個體對MPP和TEA的轉運能力下降。 OCT2 參與了包括藥物在內的一系列內外源性物質由血液經主動分泌進入腎小管腔并進一步被排泄這一生理過程。在這一過程中,位于近曲小管細胞基底外側膜上的OCT2 以異化擴散的方式將呈陽離子狀態的內、外源性物質轉運進入小管細胞。可以被OCT2 轉運的內源性物質包括去甲腎上腺素、52羥色胺、組胺、多巴胺和肌苷等。經由OCT2 轉運的藥物與OCT1 存在著很大的交叉性, 如經由OCT1 轉運的二甲雙胍、苯乙雙胍、美金剛、西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁等同時也是OCT2 的底物,另外OCT2 還轉運奎寧等其他藥物。OCT2 的抑制劑包括可卡因、地昔帕明、丙米嗪、格帕沙星、普魯卡因酰胺、奎尼丁、甲氧芐氨嘧啶、維拉帕米等。 在美洲黑人中發現495G>A（Met165Ile）、1198C>T（Arg400Cys）和1294A>C(Lys432Gln） 突變均可以導致OCT2 的轉運功能下降。在日本和韓國人中發現的2個突變596C>T( Thr199Ile)及602C>T(Thr201Met),均導致OCT2對于MPP+ 和二甲雙胍的吸收功能明顯減低。

    808G>T(Ala270Ser) 突變能夠使MPP+ 的Km 值和TEA 對于MPP+ 抑制作用的Ki 值下降大約兩倍,而此突變是OCT2 所有基因突變中頻率最高的,在所有種族中均有發現。在808G>T過表達的細胞中,MPP+ 的內在清除率下降了大約20 倍,提示OCT2的突變主要對轉運蛋白的Vmax 產生影響,而非結合的親和力。 口服二甲雙胍因為不被代謝而經由腎臟清除,而OCT2 主要分布在腎臟,所以OCT2 在二甲雙胍的分布上起重要作用。研究發現SLC22A2 三個SNPs , 596C>T、 602C>T以及808G>T突變可以導致OCT2對于二甲雙胍的攝取降低，二甲雙胍血藥濃度增高, 腎清除率降低。因為二甲雙胍主要通過OCT2的主動分泌而清除, 在全部清除率中占80 %以上, 所以OCT2 轉運功能受影響必定導致二甲雙胍腎臟清除率受影響。