藥物對動物腹腔巨噬細胞的影響實驗——流式細胞術法

紅景天苷不僅具有抗衰老、抗抑郁、抗癌、抗缺氧、保護肝臟、改善心腦血管功能和提高中樞神經系統功能等多種藥理作用，還可以起到抗疲勞、抗缺氧、抗腫瘤、抗病毒和增強免疫功能的藥理作用。巨噬細胞是機體免疫系統的重要遞呈細胞，在特異性和非特異性免疫過程中均發揮著重要的作用。

小鼠

Sal刀豆蛋白A四甲基偶氮鹽唑L-谷氨酰胺β-二巰基乙醇放線菌酮青霉素鏈霉素RPM Ⅱ1640培養基胎牛血清羧基熒光素雙醋酸鹽琥珀酰亞胺酯2-7-二氯氫化熒光素乙二脂G riess試劑盒

酶標儀流式細胞儀熒光酶標儀

一、材料準備

1.  小鼠腹腔巨噬細胞懸液的制備

（1）將BALB/c小鼠眼球放血處死，用750 mL/L 乙醇消毒小鼠皮膚后。

（2）腹腔注射5 mL RPMI1640基礎培養基。

（3）輕揉小鼠腹部5 min，從側腹壁小心抽吸出液體，收集細胞到15 mL 的離心管中，于4℃以1500 r/min，離心5 min，棄上清，用RPMI1640基礎培養基重懸，并將細胞密度調整為2×10⁹個細胞/L，接種到96/24孔細胞培養板中，于37℃、50 mL/L CO₂培養箱培養。

（4）3 h 后棄上層培養液，用冷的RPMI1640基礎培養基輕輕洗滌2次，去除未貼壁細胞即得已貼壁的巨噬細胞。

二、實驗步驟

1.  對照實驗

（1）實驗設置空白對照組（加DMEM完全培養液）、對照組（加巨噬細胞懸液）、Sal80 μmol/L 組、Sal160 μmol/L 組和Sal320 μmol/L 組，每組設3個復孔。

（2）將取密度為2×10⁹個細胞/L的腹腔巨噬細胞接種于96孔板中，每孔添加190 μL的RPMI1640基礎培養基，并加入10 μL的Sal工作液，使其終濃度分別為80 μmol/L、160 μmol/L 及320 μmol/L，于37℃、50 mL/L CO₂培養箱中培養48 h。

（3）每孔加入20 μL （質量濃度為5mg/L）MTT，避光孵育4 h 后，離心（1500 r/min，5 min）棄上清，每孔加100 μL 二甲基亞砜（DMSO），于振蕩器上避光振蕩10 min 以溶解孔底紫色結晶，在酶標儀于490 nm 波長檢測各孔吸光度值，并計算細胞的相對存活率。

（4）細胞相對存活率=[（不同濃度的Sal組的A值-空白對照組的A值）/（對照組的A值-空白對照組的A值）]×100%。

2.  采用MTT比色法檢測

（1）實驗設對照組、LPS+IFN-γ組和Sal+LPS+IFN-γ組，每組設3個復孔。

（2）將密度為2×10⁹個細胞/L的腹腔巨噬細胞接種到96孔板中，每孔添加190 μL的RPMI1640基礎培養基，并加入10 μL不同濃度的Sal（終濃度為80、160、320 μmol/L）培養4 h。

（3）加入LPS9（終濃度為10 mg/L）和IFN-γ（終濃度為80 μg/L），于37℃、50 mL/L CO₂培養箱中培養48 h。

（4）每孔加入20 μL的MTT（終濃度為5mg/L），繼續培養4 h后離心（1500 r/min，5 min）。

（5）棄上清，每孔加入100 μL DMSO，震蕩10 min，酶標儀于波長490 nm檢測A值，并計算Sal對巨噬細胞的增殖促進率。

（6）促進率=[（Sal+LPS+IFN-γ組的A值—LPS+IFN-γ組的A值）/LPS+IFN-γ組的A值]×100%。

3.  采用SytoxGreen染色法檢測

（1）實驗設對照組、CHX和Sal+CHX組，每組設3個復孔。

（2）將密度為2×10⁹個細胞/L的腹腔巨噬細胞接種到96孔板中，添加190 μL RPMI1640基礎培養基，將10 μL終濃度為160 μmol/L的Sal工作液加入到貼壁的巨噬細胞中。

（3）培養4 h 后，在CHX組加入終濃度為0.5 μmol/L 的CHX，繼續于37℃、50 mL/L CO₂孵箱中培養48 h。

（4）加入終濃度為0.5 μmol/L的Sytox??Green對96孔板中的巨噬細胞室溫下染色15 min，用熒光酶標儀檢測巨噬細胞Sytox  Green染色的熒光強度。

4.  采用免疫熒光微球法檢測

（1）實驗設對照組、LPS+IFN-γ組、不同濃度的Sal組和Sal+LPS+IFN-γ組，每組設3個復孔。

（2）將密度為2×10⁹個細胞/L的腹腔巨噬細胞接種到24孔培養板中，每孔加500 μL RPMI1640基礎培養基，并加入10 μL 不同濃度的Sal（終濃度為80、160、320 μmol/L）。

（3）37℃、50 mL/L CO₂培養箱4 h。

（4）加入終濃度為10 mg/L的LPS和終濃度為80 μg/L的IFN-γ，于37℃、50 mL/L CO₂培養箱中孵育24 h，最后加入直徑為1 μm 的熒光微球（終濃度為1×10¹⁰/L），繼續培養2 h。

（5）輕輕吸掉上清，用PBS輕輕洗滌清除未吞噬的微球，然后用胰酶將貼壁的腹腔巨噬細胞消下來。

（6）收集細胞，離心（1500 r/min，5 min），用200 μL PBS重懸后立即用FCM進行檢測。

5.  采用H2DCFDA染色法檢測

（1）實驗設對照組、LPS+IFN-γ組和Sal+LPS+IFN-γ組，每組設3個復孔。

（2）按照密度為2×10⁹個細胞/L的腹腔巨噬細胞接種到96孔培養板中，每孔加入190 μL 的RPMI1640基礎培養基，并加入10 μL 不同濃度的Sal（終濃度為80、160、320 μmol/L）。

（3）37℃、50 mL/L CO₂培養箱4 h。

（4）加入終濃度為10 mg/L 的LPS和終濃度為80 μg/L的IFN-γ，于37℃、50 mL/L CO₂培養箱中孵育24h。

（5）棄上清，用終濃度為5 μmol/L 的H2DCFDA染液，每孔加100 μL 染液避光室溫染色30 min。

（6）用熒光酶標儀進行檢測，其發射光波長為485 nm，檢測光波長為520 nm。

6.  采用Griess試劑盒法檢測

（1）實驗設對照組、LPS+IFN-γ組和Sal+LPS+IFN-γ組，將密度為2×10⁹個細胞/L的腹腔巨噬細胞接種到24孔培養板中。

（2）每孔加500 μL RPMI1640基礎培養基，并加入10 μL不同濃度的Sal（終濃度為80、160、320 μmol/L）。

（3）37℃、50 mL/L CO₂培養箱培養4 h。

（4）加入終濃度為10 mg/L 的LPS和終濃度為80 g/L 的IFN-γ。

（5）37℃、50 mL/L CO₂培養箱中孵育24 h，吸取50 μL 上清于96細胞培養板中，按Griess試劑盒說明書進行檢測，用酶標儀于波長540 nm 檢測A值。

（6）同時按Griess試劑盒說明書繪制標準曲線并計算得出各組產生的NO量。

7.  統計學分析：結果用x±s表示，n為樣本量。統計作圖軟件用MicrosoftExcel。組向比較采用One-wayt檢驗，P<0.05為具有統計學意義。

一、討論

巨噬細胞免疫調節作用的發揮是通過其抗原提呈、吞噬作用和分泌多種細胞因子而實現的。巨噬細胞發揮其免疫功能的基礎是細胞的存活，其存活狀態直接影響著其功能的發揮及應答的強弱。

對細胞存活的保護作用一般從兩個方面完成：一是促進細胞生長，二是抑制細胞凋亡。為此，本實驗針對巨噬細胞設計了一系列的實驗，結果發現，Sal能促進小鼠腹腔巨噬細胞在LPS刺激下的增殖反應，提示Sal可能是作為次級信號對LPS和IFN-γ促進巨噬細胞的信號轉導及細胞因子的分泌有協同作用，從而促進其增殖。因此提示，Sal可能對小鼠的固有免疫有增強作用。

本實驗的結果表明，Sal對CHX誘導的細胞凋亡具有抑制作用。已知CHX是一種蛋白質合成抑制劑，可通過直接與蛋白轉位酶結合，干擾轉錄過程從而抑制蛋白合成。故我們推測，Sal可能通過某些途徑阻斷了CHX與蛋白轉位酶的結合進而抑制CHX誘導的細胞凋亡。

從上述兩個實驗結果中可以得出Sal對小鼠腹腔巨噬細胞的存活具有保護作用。吞噬功能是巨噬細胞的重要功能之一，巨噬細胞通過吞噬侵入的病原體及體內衰老、畸變的細胞而提高機體的抗感染能力。

巨噬細胞對病原體等抗原性異物的識別是通過其表面模式識別受體（patternrecognitionreceptor，PRR）直接識別某些病原體或其產物所共有的高度保守的特定分子結構，或通過表面IgGFc受體（Fc??R）和補體受體（CR）識別IgG或補體結合的病原體。

巨噬細胞和病原體等抗原性異物結合后，經過吞噬或吞飲作用將病原體等攝入胞內形成吞噬體。在吞噬體內，可以通過氧依賴和氧非依賴的殺菌系統殺傷病原體。我們研究了Sal對巨噬細胞吞噬功能的影響，結果表明，Sal均能明顯提高巨噬細胞在靜息態和活化態的吞噬功能，推測Sal可能是通過某個分子結構或生物學機制，促進巨噬細胞表面的PRR和病原體或凋亡細胞表面的特定分子結構相結合，從而促進巨噬細胞的吞噬功能，增強巨噬細胞對于外來病原體的固有免疫反應。

Ryter等研究表明，ROS能夠啟動細胞的凋亡級聯反應。細胞內過量ROS的產生不但與細胞的凋亡和壞死有關，并且也與許多缺氧相關的病理學疾病（例如局部缺血損傷和腫瘤）有著密切的關系。

臨床和體內實驗均表明，紅景天對局部缺血性損傷具有保護性作用。現在研究結果表明，Sal是紅景天的主要活性成分，并能對缺氧造成的胞內過量ROS的產生而誘導的細胞凋亡具有保護性作用。Sal能清除機體內不同種類的超氧陰離子自由基和羥基自由基，因此，本實驗研究了Sal對LPS和IFN-γ誘導的腹腔巨噬細胞胞內ROS產生的影響。

結果顯示，Sal能顯著降低活化巨噬細胞胞內的ROS，提示Sal的保護機制可能是直接清除腹腔巨噬細胞內的ROS，從而對過量ROS引起的腹腔巨噬細胞的凋亡起保護作用。

NO作為活化的巨噬細胞分泌的一種非特異性分子，能夠殺滅或抑制多種病原微生物生長。巨噬細胞內的NO是通過NOS途徑合成，其合成能力與抗炎作用密切相關。NO的合成可由IFN-γ所誘導，然而該誘導過程通常需要第二信號（TNF-及不同微生物成分如LPS）的存在。IFN-γ或第二信號單獨作用時，可誘導巨噬細胞合成低量的NO，但在許多情形下，沒有直接的細胞毒性作用；但IFN-γ和第二信號共同作用時，可顯著提高NO的產生，并增加巨噬細胞的細胞毒性作用。

謝樂斯等研究表明，Sal免疫小鼠的腹腔巨噬細胞能顯著提高殺傷HCa-F肝癌細胞的能力，推測Sal可能是通過iNOS介導的NO合成進而發揮殺瘤效應。

Seo等研究表明，Sal能促進IFN-γ活化的RAW264.7轉錄和表達iNOS基因，但Sal單獨作用于靜息的RAW264.7時，對iNOS基因的表達沒有影響。

我們研究了Sal對腹腔巨噬細胞分泌NO的影響。結果表明，Sal對LPS和IFN-γ誘導活化的腹腔巨噬細胞分泌NO有協同作用，提示Sal可能是作為次級信號促進腹腔巨噬細胞中iNOS基因

的表達，從而促進腹腔巨噬細胞NO的產生，這可能是機體抗病原微生物和抗腫瘤作用的機制之一。

總之，Sal能增強巨噬細胞在靜息態和活化態的吞噬功能，同時能促進NO的分泌并減少巨噬細胞胞內ROS的產生，且毒副作用小，提示其能提高整個機體固有免疫的功能，有可能成為腫瘤、感染、自身免疫病、免疫缺陷病等的輔助治療藥物，和使其成為一種很有前途的免疫調節劑。