薄層色譜的原理及應用要點

薄層色譜，或稱薄層層析（thin-layer chromatography），是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動相，對混合樣品進行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術。這是一種快速分離諸如脂肪酸、類固醇、氨基酸、核苷酸、生物堿及其他多種物質的特別有效的層析方法，從50年代發展起來至今，仍被廣泛采用。

一、基本原理

薄層層析是把支持物均勻涂布于支持板（常用玻璃板，也可用滌綸布等）上形成薄層，然后用相應的溶劑進行展開。薄層層析可根據作為固定相的支持物不同，分為薄層吸附層析（吸附劑）、薄層分配層析（纖維素）、薄層離子交換層析（離子交換劑）、薄層凝膠層析（分子篩凝膠）等。一般實驗中應用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析。

吸附是表面的一個重要性質。任何兩個相都可以形成表面，吸附就是其中一個相的物質或溶解于其中的溶質在此表面上的密集現象。在固體與氣體之間、固體與液體之間、吸附液體與氣體之間的表面上，都可能發生吸附現象。

物質分子之所以能在固體表面停留，這是因為固體表面的分子（離子或原子）和固體內部分子所受的吸引力不相等。在固體內部，分子之間相互作用的力是對稱的，其力場互相抵消。而處于固體表面的分子所受的力是不對稱的，向內的一面受到固體內部分子的作用力大，而表面層所受的作用力小，因而氣體或溶質分子在運動中遇到固體表面時受到這種剩余力的影響，就會被吸引而停留下來。吸附過程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸出來。在單位時間內被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時間內離開此表面的分子之間可以建立動態平衡，稱為吸附平衡。吸附層析過程就是不斷地產生平衡與不平衡、吸附與解吸的動態平衡過程。

例如用硅膠和氧化鋁作支持劑，其主要原理是吸附力與分配系數的不同，使混合物得以分離。當溶劑沿著吸附劑移動時，帶著樣品中的各組分一起移動，同時發生連續吸附與解吸作用以及反復分配作用。由于各組分在溶劑中的溶解度不同，以及吸附劑對它們的吸附能力的差異，最終將混合物分離成一系列斑點。如作為標準的化合物在層析薄板上一起展開，則可以根據這些已知化合物的Rf值（后面介紹Rf值）對各斑點的組分進行鑒定，同時也可以進一步采用某些方法加以定量。

薄層層析有許多優點：它保持了操作方便、設備簡單、顯色容易等特點，同時展開速率快，一般僅需15～20分鐘；混合物易分離，分辨力一般比以往的紙層析高10～100倍，它既適用于只有0.01μg的樣品分離，又能分離大于500mg的樣品作制備用，而且還可以使用如濃硫酸、濃鹽酸之類的腐蝕性顯色劑。薄層層析的缺點是對生物高分子的分離效果不甚理想。

二、固定相支持劑的選擇和處理

在薄層層析時，對支持劑的選擇主要考慮兩方面：一是支持劑的性質與適用范圍；二是支持劑的顆粒大小。一般來說，所選吸附劑應具有最大的比表面積和足夠的吸附能力，它對欲分離的不同物質應有不同的吸附能力，即有足夠的分辨力；所選吸附劑與溶劑及樣品組分不會發生化學反應。吸附力的強弱規律可概括如下：吸附力與兩相間界面張力的降低成正比，某物質溶液中被吸附的程度與其在溶劑中的溶解度成反比。極性吸附劑易吸附極性物質，非極性吸附劑易吸附非極性物質。同族化合物的吸附程度有一定的變化方向，例如，同系物極性遞減，而被非極性表面吸附的能力將遞增。