5.電泳
操作步驟：
1）將蛋白樣品于等體積的2×上樣緩沖液混合，10000×g離心5min以除去蛋白質沉淀；2）用微量注射器將蛋白質樣品加入到上樣空底部，注意不要溢出來。注意：對于考馬斯亮藍染色液來說，每個泳道10-30ug的蛋白混合粗提物（我們俗稱粗抗原）或者5-10ug單一蛋白組分是較合理的上樣濃度。
電泳液：
1）上槽中加入陰極電泳液（20mM氫氧化鈉：須由1M儲存液新鮮配置）；
2）下槽中加入陽極電泳液（10mM磷酸：須由1M儲存液新鮮配置）。
等電聚焦電泳條件：
1）接好電極；
2）恒壓150V電泳30min；
3）恒壓200V電泳2.5h，開始時候控制電流為10mA左右，在聚焦過程中電流有所下降，電泳內室溫度在電泳的過程中將升至40－50攝氏度。
6．電泳聚焦后處理
測定pH梯度：
1）將凝膠條切成0.5cm或1cm的小片；
2）將每小片凝膠在1ml 10mM KCl中 浸泡30min；
3）測讀此KCl溶液的pH值、
凝膠的固定：
1）將凝膠于10%三氯乙酸中浸泡10min；
2）換成1%三氯乙酸溶液繼續浸泡至少2h以上，以去除載體兩性電解質，浸泡過夜可以更好的降低考馬斯亮藍對載體兩性電解質的染色。
凝膠的染色：用考馬斯亮藍染色，然后脫色，制成干膠。
7.天然等電聚焦電泳的修正方案
如果要進行天然等電聚焦電泳，要做一些修改；
1） 膠過程中配的凝膠中不需要加尿素；
2）上樣緩沖液（2×）5ml：其中1.8ml水，200μl載體兩性電解質（同制膠成分），3ml甘油，上樣時候于等體積樣品混勻，10000×g離心5敏即可上樣；
3）室溫下電泳，接好電極，恒壓下先200V電泳1.5h，再400V電泳1.5h。