（六）興風作浪的乳糖(lactose)
晚上每天都有人做報告，我覺得讓我收獲最大的是Bill Studier的報告。本來這個報告是后來才聽到的，但是由于Burgess的模塊是唯一的涉及大腸桿菌鐘表達蛋白的，我把這一段提前來說說。Studier這老哥是Brookhaven National Laboratory的，一生研究T7 噬菌體，也是T7 RNA polymerase induction system(pET 系列質粒)的發明者。
T7 系統在大腸桿菌表達蛋白的應用實在太廣泛了，但凡表達蛋白的兄弟姐妹們的不可能不知道這個系統。長話短說，pET系列的質粒都用T7 promoter來控制基因的表達。T7 promoter只能被T7 RNA polymerase 識別，而這個咚咚大腸桿菌是沒有的。但是有一些溶原菌株,染色體里面已經整合入了由LacUV promoter和lac operon控制的T7 RNA polymerase 基因片斷。如果在細菌培養基里面加入IPTG, 來誘導T7 RNA polymerase 的表達，就可以啟動目的蛋白的表達。這個系統非常強大，原因
在于T7 RNA polymerase工作起來非常有效率，效率高到什么地步呢？就是表達一個蛋白，表達量可以占到大腸桿菌總蛋白量的50%! 大家可以想象，這種系統雖然很強大，但是表達量太大，對大腸桿菌有毒性，造成的結果就是大腸桿菌十分排斥表達蛋白的質粒。
這一點我深有體會。我曾經想用細菌表達一個蛋白,而且估計這個蛋白會形成包涵體。妖怪的是，用質粒轉化蛋白表達菌株BL21(DE3)怎么也不能轉化，鋪的板一個菌落也沒有。我當時就懷疑是因為表達的蛋白對大腸桿菌有毒性，僅僅是本底的一點表達就足以殺死細菌。我來來回回一共轉化了五六次，最后終于找到了唯一的一個菌落。雖然當時我懷疑過本底表達是罪魁禍首，但是我沒有仔細想過本底是怎么
來的。
這個問題到了bill studier做報告之后，才真相大白。原來我們一般用的LB broth有三種成分，其中一種是tryptone. Tryptone是caseine的酶解產物，而casein又是milk里提取而來。由于milk 有乳糖(lactose)，tryptone里面也有乳糖的污染。Bill studier研究發現即使很微量的lactose也能有效的誘導蛋白表達。原來如此！！！
所以要解決我原來的那個問題，用一種不含有乳糖的media做培養板就完事了。有意思的是，細菌有一種很有意思的特點，如果培養基里有足量的glucose，細菌會優先攝取glucose,而不能攝取lactose。Bill studier根據這個特點研究出一種可以自動誘導的培養基。這種培養基含有成比例的glucose 和 lactose。細菌首先攝取glucose，不攝取lactose,當細菌長到一定密度，耗完glucose之后，就開始攝取lactose,從而開始誘導表達。所以用這種培養基養菌，很省事，接種了第二天收細菌，提蛋白就行了。
最后Bill studier老爺子特別強調的是細菌的供氧。氧氣是限制細菌生長最重要的瓶頸, 如果有足夠氧氣在培養基里面, 大腸桿菌的密度可以從一般的OD600 2~3 翻十倍到20~30!要提高培養瓶的供氧，可以用baffled flask。這種flask的瓶底邊緣有幾處凹陷(類似于可樂塑料瓶底那樣的形狀)，能有效增加空氣培養基的混合。
最后，詳細內容可以見下列文獻:
Protein Expression and purification 41: 207-234 (2005)
（七）古怪的CDC6
這里再給大家講一個在大腸桿菌中表達蛋白質的例子，一個很夸張的例子，但是很有啟發性。
Bruce Stillman 是冷泉港的現任主管，是一個絕對的牛人。不但科學做得很好，而且還很愛國。他是澳洲人，在美國待了N年，卻從沒有加入美國國籍，所以他只是外籍院士。我們的晚間報告有一個是他作的。他主要研究真核生物的DNA復制。這是一個到現在為止都沒有完全弄明白的領域。在報告里面，他特別提到了表達純化CDC6蛋白的經歷，我覺得十分有意思。這個蛋白, 用他的話說，是\"a pain in the ass\"。
CDC6是干什么的呢？這要從ORC說起。真核生物的DNA有多個復制起始位點 (replication origin)，ORC(Origin Replication Complex)是一個很大的蛋白復合體，可以識別這些復制起始位點。ORC在整個細胞周期里面都是與DNA結合的。在G1期里面，CDC6這個蛋白會與ORC結合，同時讓MCM(DNA解旋酶)也裝載到ORC上,形成一個prereplication protein complex。這個complex一旦形成，DNA 復制的準備工作就完成，只等其他kinase的激活，細胞從G1進入S期，復制就開始。
Stillman 實驗室一直想表達酵母的CDC6和ORC的重組蛋白，然后做結構研究。但是到了CDC6，他們碰到了大麻煩。首先他們嘗試真核系統來表達，但是意外的是，他們發現表達出來的CDC6完全沒有活性。然后他們嘗試用大腸桿菌來表達。首先發現37度誘導表達出來的蛋白不溶，重折疊也沒有用。然后他們嘗試在室溫下誘導表達，發現蛋白雖然可溶了，但是都被降解了。然后呢，他們就想到了加一個GST tag,這下好了，蛋白也可溶了，也不被降解了，但是還是沒有活性。他們估計是因為GST可以形成dimer，干擾CDC6的正常功能。所以呢，他們重新做了一個construct,在GST和CDC6序列中間加了一個蛋白酶切割位點。正當他們滿心歡喜的以為問題解決了的時候，意外又出現了。有GST的CDC6是可溶的，可是一旦把GST切掉了，CDC就沉淀出來了....@#%#^&%$^#!!!
幾乎是山窮水盡了，但是做這個project的博士后還是沒有放棄希望，他做了最后的孤注一擲。他猜到這個蛋白可能很不穩定，對緩沖液要求可能很高，所以他讓一個本科生連續試了十多種buffer，最后發現如果用磷酸鉀＋谷氨酸鉀緩沖液，切掉GST之后CDC6就不會沉淀了。Stillman認為谷氨酸根和磷酸根跟氯離子相比更接近與核酸, 可能讓CDC6更穩定。這個CDC6一共花了他們18個月時間, 卻就這一點小trick!
這以后，他們表達的CDC6都有活性了，后來做了一系列的電鏡三維結構重構實驗，研究CDC6和ORC的復合體結構。Stillman實驗室正在準備一篇文章要投到nature上去。大家等著看把。
（八）”液體DEAE“
繞了這么大一圈，現在再回到第一個模塊的實驗來。前面提到Dr.Burgess要我們
試Gudn HCl溶解sigma32之后的重折疊，結果很糟糕。我們接著試了用sarkosyl做
變性劑的蛋白重折疊。步驟和前一個類似，只是這一次是突然稀釋至25倍體積。效果好了很多，至少沒有渾濁現象了。接著我們用Poros HS 50，一種陽離子交換柱，來把可溶的sigma 分離了出來。為什么這一次用Poros HS 50 而不是前面用的陰離
子交換柱呢？因為sarkosyl帶負電，會與陰離子交換柱結合得很好。再加上sigma32
很奇怪，既有負電的表面，又有帶正電的表面，所以可以用陽離子交換柱。值得一提的是絕大部分蛋白質都是偏酸性，所以陰離子交換柱用的比陽離子交換柱頻繁得多。
好了，聊完離子交換柱，現在回到Dr Burgess要我們作的另一個很重要的實驗。
Sigma32在大腸桿菌過表達的時候，絕大部分都是inclusion body,但是也有一部分
是可溶的。這些可溶的sigma 32可以和細菌體內的Core RNA polymerase結合形