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  • 發布時間:2021-05-20 16:00 原文鏈接: 蛋白質免疫印跡實驗組織蛋白提取

      組織蛋白提取

      1)所需器材:制冰機、標記筆、兩套1.5ml EP管(最好高溫高壓處理)、一個大冰盒、一個1.5ml EP管盒、手套、眼科剪(最好高溫高壓處理)、新鮮組織或保存于-80℃冰箱組織、保存于4℃冰箱的PBS(最好高溫高壓處理)、移液槍、吸頭(最好高溫高壓處理)、兩套研磨棒(最好高溫高壓處理)、掌上離心機、濾紙、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟(PMSF,一種蛋白酶抑制劑,劇毒)、離心機、燒杯、2×SDS凝膠上樣緩沖液、二硫蘇糖醇(DTT)、震蕩器、泡沫板。

      2)操作步驟:

      a.制冰機制冰;

      b.標記筆將兩套EP管做好標記;

      c.將大冰盒、EP管盒裝上冰,一套標記筆做好標記的EP管放置于大冰盒中,另一套標記筆做好標記的EP管放置于EP管盒中,戴好手套,帶上EP管盒、眼科剪剪取黃豆大小(約100mg)新鮮組織或保存于-80℃冰箱組織;

      d.取出保存于4℃冰箱的PBS,往EP管中滴加1ml PBS,眼科剪剪碎組織(動作快),掌上離心,棄上清,再往EP管中滴加1ml PBS,研磨棒研磨,3000轉離心10分鐘,棄上清,濾紙盡可能吸干管口殘留液體,估算EP管中沉淀物體積,以上步驟盡可能在冰上操作;

      e.從4℃冰箱取出三去污裂解液,-20℃冰箱中取出PMSF置于大冰盒中,往EP管中滴加沉淀物3-5倍體積的三去污裂解液(一般為5倍),再加入PMSF(二者比例為94:6),研磨棒研磨(冰上充分裂解20-30分鐘),以上步驟均需在進行;

      f.離心機預冷,將充分裂解后的組織液4 ℃、10000轉離心10分鐘;

      g.將燒杯用自來水洗凈,倒入單蒸水,電爐上煮沸;

      h.備好2×SDS凝膠加樣緩沖液(存放于常溫),取出保存于-20℃冰箱的DTT,置于大冰盒中,將離心后的上清液用移液槍定量吸至另一套EP管中(勿吸取下層沉淀物),按上清液:2×SDS:DTT =1: 0.8:0.2加入2×SDS 及DTT,掌上離心,然后小心將EP管插入泡沫板,投入已煮沸的燒杯中煮6-8分鐘(電爐功率不要調太大,以免管蓋爆開);

      i. 將泡沫板用鑷子取出,置大冰盒中冷卻10分鐘,掌上離心,再放入-20℃冰箱保存備用。

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