總蛋白質的檢測1. 總蛋白質色度法染色簡便的目視檢測、相對簡單的使用及廣大熟悉方法的用戶基礎群，使得考馬斯亮藍(C B B )—直是最普遍使用的總蛋白質凝膠染色劑。如需要比考馬斯亮藍染色更高的檢測敏感度，那么銀染法是可選擇的色度方法。如果需要對切下的蛋白質進行質譜分析，則首選不會引入共價蛋白質修飾的染色方法。 總蛋白質的檢測1. 總蛋白質色度法染色簡便的目視檢測、相對簡單的使用及廣大熟悉方法的用戶基礎群，使得考馬斯亮藍(C B B )—直是最普遍使用的總蛋白質凝膠染色劑。如需要比考馬斯亮藍染色更高的檢測敏感度，那么銀染法是可選擇的色度方法。如果需要對切下的蛋白質進行質譜分析，則首選不會引入共價蛋白質修飾的染色方法。 考馬斯亮藍染色 考馬斯亮藍 R -250 及其二甲基衍生物考馬斯亮藍 0 2 5 0 均為三苯代甲焼二橫酸鹽染料 ，能將蛋白質條帶染成亮藍色。染色條帶通過靜電作用同質子化了的堿性氨基酸 (賴氨酸 、精氨酸和組氨酸) 相互作用，并通過疏水作用與芳香族殘基的疏水締合。染料不與聚丙稀酰胺高親和力結合，但卻會滲透凝膠介質并與其低親和力結合, 因此需要脫色步驟，除非染液為膠體配方。通常采用考馬斯亮藍作為終點染色劑，其為固定和染色步驟提供
重要的靈活應變的時間。考馬斯亮藍染色劑是非共價且可逆的，并且不會干擾隨后切+的蛋白質條帶的質譜分析。 考馬斯亮藍R-250的染色在酸性乙醇條件下完成，用量為考馬斯亮藍R -250
0.025%?0.10%(m/V 染液）、30%? 50%( V/V) 甲醇（或乙醇，不及甲醇常用）搭配7 % ?1 0 % ( V /V ) 乙酸溶液。染料溶解后將溶液用 W h a t m a n 1 號濾紙過濾，產生穩定的組成 。固 定 和 染 色 通 常 在 約 1 0 倍 凝 膠 體 積 的 溶 液 中 完 成 ，如 標 準 的 微 型 凝 膠 需 要50 m L 。為追求最敏感和始終一致的結果，凝膠的固定和染色需要在同樣的乙酸溶液中進行。在此條件下，凝膠發生收縮。在 7 % 乙酸中脫色，減少乙醇可以使凝膠恢復完整大小 。脫色通常需要幾次溶液的更換，加人染料吸附紙或泡沫橡膠/塑料可加速脫色。 在完全分析考馬斯亮藍染色法后，可得知, 膠體配方不利于染色劑有效進入膠體介質之 中 會 特 定 結 合 在 蛋 白 質 帶 上 ，從而使定量可靠, 靈敏度也越加接近上文所述標準考馬斯亮藍 R -250 染 g 法 ，使低背景的染色成為可能。用于膠體染色劑時，考馬斯亮藍250 要優于考馬斯亮藍 R -250。初始配方是將〇.1 % 考馬斯亮藍 g _250 溶 解 在 2% (?w/v)
憐酸 ，6% 〇 n /V ) 硫 酸 銨 中（Neuhoff et al. ，1985)。一 種 改 善 的 廣 泛 使 用 的 配 方 為 ，將10%( W V ) 硫酸銨溶解在 2 % W V ) 磷酸中，隨后加入 5 % ( m /V ) 考馬斯亮藍 0 2 5 0 儲備水溶液至終濃度為〇.l % ( w /V ); 染色前需先加人甲醇至終濃度為 20%(V /V ) ( N e u h o f fet al.，1988)。添加甲醇可增加單分散染料的比例, 會導致染色加快，條帶明顯，但一些背景色也會變明顯; 增加硫酸銨的濃度會驅使染料變成膠體狀態。此外, 更新的配方建議加大染料和磷酸濃度，即最終配方中應含有 0.12%( m /V ) 染 料 、1 0 % ( OT/V ) 硫 酸銨、1 0 %(m . V ) 磷酸及 2 0 % ( V /V ) 甲醇，所有成分形成單一的穩定溶液。制備時, 需要依次在水中加入上述量的磷酸、硫 酸 銨 及 粉 狀 染 料 ，至 終 體 積 的 8 0 % ，然后加人甲醇至終體積(Candiano et al. ，2 〇〇 4)。膠體染料溶液不能過濾。 大部分商業渠道可獲得的考馬斯亮藍染料配方，是在上述各種配方和方案的基礎上衍生而來的。 關于固定的建議眾多，在電泳后用水清洗凝膠以除去染料溶液中的多數 S D S , 清洗時間可以是幾小時至過夜, 該簡單程序有助于觀察到良好的結果。蛋白質條帶在幾分鐘內就可以觀察到, 背景起初澄清, 最后呈淡藍色。染色之后用水清洗凝膠以減弱背景。最近有一個簡單實用的考馬斯亮藍染色方案的總結，包括一種「熱」考馬斯亮藍染色方案，即在90°C 用基于乙酸的考馬斯亮藍 R -250 染液配方染色; 或是一種「快速」的 5(T C 下基于三氯乙酸的考馬斯亮藍〇——250 膠體染料的方案 。可由商業渠道獲得的 一
些方案還包括利用簡單的基于微波爐加熱的方案來加速考馬斯亮藍 0250 膠體染料的染色 (和脫色）。 銀染法 人們普遍認為銀染法是其他所有超靈敏的染色方法的標準，是最復雜和可變的蛋白質凝膠染色方法學，已有好幾十個已出版的方案，所有的方案都需要若干個階梯式的步驟; 蛋白質檢測的基礎是將與蛋白質相結合的銀離子還原成金屬銀，或者如較少情況下在某些方案中出現的，造成局部的硫化銀沉淀。銀染法可以作為極限檢測靈敏度的嚴格標準 ，而定量不是一個簡單的任務，它取決于顯色步驟的復合物的性質和不同蛋白質間的銀信號靈敏度的差異。有商業渠道可獲得的銀染試劑盒，試劑盒采用各種文獻中的經過驗
證的方案和試劑混合物，能夠為初次使用者提供可重復的結果。對于那些想要改進和優化用于常規內部使用的「自制」銀染試劑和方案的人來說，這也是一種重要的學習和基準確立工具。 Merril(1990)、R a b i U o u d (1990) 和 P o l a n d 等 (2005) 修訂和總結了 銀 染 法 的 原
理 、方法及方案。 關鍵步驟通常如下所述。 (1) 固定凝膠，以固定蛋白質條帶，并移除凝膠中的干擾物質, 如 S D S 、緩沖液和鹽，這些物質會結合銀并造成背景染色。 (2) 用能夠結合蛋白質并提高銀結合能力的物質, 或是能夠干擾剩余未結合的銀造成的背景染色的物質來孵育凝膠。總之，這些各種各樣的方法都和敏化作用有關。 (3) 銀離子浸泡處理凝膠。 (4) 結合的銀離子還原成不溶且可見的金屬銀，便出現了有色度的銀染信號。 (5) 終止顯色過程，以防止凝膠介質中的背景染色遮掩住蛋白質條帶。后兩個步驟對時間的依賴導致了技術的復雜性, 步驟 (2)?(4) 中幾次需要一定時間的清洗步驟也是如此。 銀染法在銀試劑和相應顯影條件的基礎上明顯存在區別。堿性法將堿性環境下一種銀的二元胺復合物作為銀試劑, 并在酸性甲醛溶液中顯影; 酸性法將弱酸性硝酸銀作為銀試 劑 ，并在堿性甲酸溶液中顯影。酸性染色法最近變得更受歡迎，因為它相對于堿性法降低了成本，并且背景染色也更容易控制。 目前有很多增敏劑。芳香族橫酸鹽 (如二磺酸萘或磺基水楊酸) 能結合蛋白質，也能結合銀; 剩余的與蛋白質結合的 S D S 也可以加強銀的結合力。同樣的，已被考馬斯亮藍染色的凝膠，如果再進行銀染，同樣可以提髙銀染的強度。戊二醛作為增敏劑得以廣泛使用, 其原理在于引入了還原性醛基，能同蛋白質中的自由氨基相結合。硫化試劑，如連四硫酸鹽或硫代硫酸鹽能在蛋白質附近引入自由 S2- ，該離子會立即與銀離子反應并形成不溶的硫化銀。 因為在固定和增敏過程中使用戊二醒會造成蛋白質修飾，故銀染后進行的蛋白質質譜分析會有問題。那些能同質譜分析相兼容的方法都不使用戊二醛，而這可能會使敏感性相對降低。增敏步驟若依靠連四硫酸鹽和硫代硫酸鹽，顯影步驟將會相應地延長。因此 ，若銀染后需要質譜分析，可以先對膠體進行考馬斯亮藍染色，再進行無戊二醛的銀染步 驟 ，這是一種便捷的兩步估算出蛋白質樣品純度的色度方法。 Zn 2+ 反染法 在 S D S -P A G E 后 ，不依靠固定劑或有機染料，使用金屬陽離子快速對蛋白質染色的方法有很多。 Z n 2+反染法利用的是蛋白質和蛋白質-S D S 復合物結合及隔離環境中的Z n 2+ , 而在此環境中咪唑和 Z n2+之間因沉淀反應會產生咪唑鋅 (Z n I m 2), 并產生不透明的背景，同透明的蛋白質-S D S Z n 2+ 區域形成對比。該技術是一種非固定步驟, 在隨后預期的微量分析，如洗脫條帶的生物分析或酶分析中很有幫助，并且能同質譜分析或微量測序方法相兼容。該染色法迅速快捷，但檢測靈敏度低于考馬斯亮藍染色法。 用 于 I m m 厚度的凝膠的 Z n 2+ 快速反染法步驟如下所述。 (1) 電泳之后，將凝膠浸泡在〇.2 m o l /L 咪唑、0.1% S D S 中 15 m i n 。 (2) 棄去咪唑溶液，再將凝膠浸泡人〇.3 m o l /L 硫酸鋅孵育 30?45 s 顯影。 (3 ) 棄 去 上 述 顯 影 液 ，用 水 清 洗 凝 膠 若 干 次 ，每 次 I m i n 。 (4) 將 凝 膠 保 存 在 0 . 5 % ( m /V ) 碳 酸 鈉 中 。顯 影 過 度 會 有 問 題 ，但 是 可 以 通 過 將 凝 膠 泡 在 1 〇 0 m m 〇 l/L 甘 氨 酸 以 溶 解 過 量 的Z n I m 2 來 解 決 。盡 管 不 透 明 背 景 下 的 透 明 蛋 白 質 條 帶 沒 有 像 考 馬 斯 亮 藍 染 色 法 或 銀 染 法那 樣 有 明 顯 的 顏 色 對 比 ，但 是 可 以 在 黑 色 背 景 下 照 明 凝 膠 成 像（Fernandez-Patron，2005;
Fernandez-Patron et al. ，1998) 展開 | 