溶液中蛋白質的物理性質和行為取決于與蛋白質的純化和構成及其自身固有屬性相關的多種因素。 尺寸排阻色譜 (SEC) 是一種強大的工具，常用于分析蛋白質的回收率、分子量和聚集性。
SEC 的工作原理涉及在樣品流經多孔的惰性色譜柱基質時對樣品進行分離。
較小的分子進入填料孔內，而較大的分子則被排除在外，因此可更快速地通過色譜柱。 結果是獲得基于流體力學體積的分離，但是人們通常要求得出分子量。
以前，通過比較未知蛋白質與（已知分子量的）標準球狀蛋白質的洗脫時間估算分子量，我們把這一過程稱為“傳統校正法”。 通常使用諸如紫外 (UV)
等單一的濃度檢測器完成上述操作。 然而，現在我們聯合使用光散射檢測器和濃度檢測器（紫外或折光率，RI），可不依賴保留時間測定蛋白質分子量。
這一進步非常有用，因為許多蛋白質不具有球狀結構，使得它們測得的分子量不準確。 由于增加了更多檢測器（如另一臺濃度檢測器）、特性粘度 (IV)
和動態光散射 (DLS) 檢測，可極大地增加單次 SEC 測定所獲得的信息量。
Malvern SEC-MALS 20（圖 1）系統是一款 20 角度光散射設備，能夠不依賴于洗脫體積測定蛋白質分子量。 在此應用說明中，一些蛋白質使用 SEC 進行分離。 使用多角光散射 (MALS) 或傳統校正法測定它們的分子量， 并討論了這些結果的差異。
圖 1：Viscotek SEC-MALS 20 系統
材料和方法
將 SEC-MALS 20 系統連接至使用 TDA RI 檢測器的 Viscotek
TDAmax 系統以測定濃度。 樣品沿 2 根 Viscotek 蛋白柱以磷酸鹽緩沖液作為流動相進行分離。 所有蛋白質樣品均溶解在流動相中。
使用牛血清白蛋白（一種分子量表征良好的蛋白質）校準 SECMALS 20 系統。 使用一系列球狀蛋白質（用于分子量為
29,000-700,000 Da 的蛋白質的凝膠過濾標記物試劑盒，Sigma-Aldrich）進行色譜柱校正。
該檢測器和色譜柱均置于 30°C 環境下，以確保良好的分離效果和最佳的檢測器基線穩定性。
結果
作為系統驗證，應經常檢查校準品，而 BSA 二聚體（通常存在于 BSA 樣品中）是一種極好的檢驗標準品。 這種情況下，已正確測定二聚體的分子量，并對樣品中存在的三聚體進行了精確測定。 BSA 色譜圖見圖 2，而 BSA 測定的結果見表 1。 圖 2 也顯示了BSA 的 SEC-MALS 色譜圖。 作為一種各向同性散射體，BSA 的峰大小和檢測器響應在各角度均相同。 可清楚地看到各峰的分子量均非常穩定。 這種情況預計出現在分子量受到嚴格控制并被認為具有單分散性的蛋白質中。 上述結果和分子量數值表明這些峰是 BSA 的不同寡聚體。
圖 2：BSA 的色譜圖顯示 RI（紅色）和 SEC-MALS (90°)（桔色）檢測器信號。
圖 3：BSA 的 SEC-MALS 20 檢測器信號色譜圖。