蛋白質的提取及粗分離實驗——硫酸銨鹽析法

分離純化蛋白質，首先要從原材料中提取目的蛋白，然后通過粗分離的方法除去大量雜質，最后進行精細分離，得到目的蛋白。本實驗以新型基因重組人TNF為例闡明重組蛋白TNF的提取及初步分離。
 

TNF的提取是將發酵菌體裂解，在一定的條件和溶液中，使被提取的TNF充分釋放出來，經離心收集混合液中提取的TNF成份的過程。含有TNF的提取溶液中，含有大量的雜蛋白，由于蛋白質在水溶液中的溶解度主要取決于蛋白質分子表面的水分子數目，即蛋白質表面親水基團與水分子形成水化膜的程度和帶電荷的情況，當中性鹽如硫酸銨等加入蛋白質溶液時，由于中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質，使蛋白質分子周圍的水化膜減弱或消失，蛋白質溶解度降低，同時由于中性鹽的加入，蛋白質溶液的離子強度發生了改變，蛋白質表面電荷被大量中和，更加導致蛋白質溶解度降低，使蛋白質分子之間互相聚集而發生沉淀。不同的蛋白質由于其帶電性，親水性等性質的不同，會在不同濃度的鹽中形成沉淀。依此原理可對混合蛋白質進行粗分離。該實驗中利用硫酸銨鹽析除去大部分雜蛋白從而使TNF得到初步純化。

新型基因重組人TNF

蔗糖TRIS鹽酸乙二氨四乙酸二鈉氫氧化鈉STE溶液Dnase I脫氧膽酸鈉溶液

透析袋攪拌棒滅菌鍋電子天平燒杯稱量紙藥匙量筒燒杯制冰機

一、試劑配制
 

1.  STE（25%蔗糖  10 mmol/L Tris-HCl pH 8.5 1 mmol/L EDTA）

 蔗糖       250 g

1 mol/L Tris.HCL   10 ml

0.5 mol/L EDTA     2 ml，加水至1 000 ml

115℃，20 min高壓滅菌

2.  1mol/L  MgCl₂

取  MgCl₂  203.30 g，加水至1 000 ml
 

3.  Tris-HCL  pH8.5

取Tris  121.14 g

用HCL調pH至8.5，加水至1 000 ml

（12 mol/L  HCL約30 ml）
 

4.  0.5 mol/L EDTA pH8.5

乙二氨四乙酸二鈉      186.12 g

NaOH  20 g，加水至1 000 ml

121℃，20 min高壓滅菌
 

二、操作步驟
 

1.  稱取菌體重量，按5~10 ml/g菌體加入STE溶液，攪拌至菌體完全懸浮。
 

2.  按0.5~1 mg/g菌體加入用STE溶液新鮮配制的溶菌酶溶液，用玻璃棒用力攪勻后于4℃環境中放置20 min。此時菌液呈粘稠狀。
 

3.  按10 mg/g菌體加入用STE溶液新鮮配制的脫氧膽酸鈉（DOC）溶液，用力攪勻。
 

4.  加入5~10 ml 1 mol/L MgCl₂溶液，攪勻后加入約40 μl Dnase I（25 mg/ml）充分攪拌至菌液變稀。
 

5.  15 000 rpm，4℃離心30 min。
 

6.  取離心上清，精確量取其體積，測定蛋白質濃度，倒入置于冰浴的燒杯中，邊攪拌邊緩慢加入固體硫酸銨使其達到50%飽和度。待固體硫酸銨安全溶解后，靜置于0℃環境中30 min。
 

7.  離心，15 000 rpm，4℃，30 min。取離心上清，量其體積，測定蛋白濃度。
 

8.  將離心上清裝入透析袋，4℃攪拌在pH8.5 20 mmol/L Tris-Hcl，1 mmol/L EDTA溶液中透析。
 

加入硫酸銨不論是固體硫酸銨，還是加入飽和硫酸銨溶液，加入時應邊加入邊攪拌，特別注意① 加入硫酸銨要慢，因為太快會引起蛋白質發生共沉淀，加入固體硫酸銨時事先要將硫酸銨研磨成粉末，加入飽和硫酸銨溶液時要一滴一滴地加入；② 攪拌要慢，攪拌劇烈，蛋白質溶液容易起泡沫，由于表面張力效應會引起蛋白質變性。