1.將放射性標記的肽段在小試管中溶解于 20ul 適當的溶劑中（如含或不含 0.1%TFA 的 30% 乙腈水溶液，可能會將多肽從 RP-HPLC 柱上洗脫下來）。加熱混合物至 55°C，直至溶解。 2.用契侖科夫法在閃爍計數器中計數（注音：契侖科夫計數時不加閃爍液）。 3.將 Sequelon-AA 盤從試劑盒中取出，放置于 55°C 的聚醋薄膜上。 4.滴加放射性標記的多肽到 Sequelon-AA 盤上，將盤完全干透。在閃爍計數器中對盤和樣品管進行計數。注意：仍然不加任何閃爍液。 5.清洗管 3 次，每次用 10~20ul 多肽溶劑（與溶解多肽的溶液相同）。將清洗液滴加到 Sequelon-AA 盤上，每一次滴加后待晾干才能接著再滴加。如果樣品管仍有計數信號，繼續清洗。 6.不加任何閃爍液，在閃爍計數器中檢測盤子。 7.向測試管中滴加 100ul 偶聯緩沖液，加入 1mg 水溶性的碳二亞胺試劑 EDC。 8.向空盤上滴加 5ul EDC 溶液，使反應在室溫下進行 20 min。 9.樣品偶聯后，像步驟⑤那樣用多肽溶劑清洗幾次，將沒有進行共價結合的多肽洗去—因為它們在測序時會產生背景。在閃爍計數器中對盤子進行計數。 10.用含 2 mmol/L 磷酸鈉的甲醇-水（9:1) 溶液代替 S3 試劑（氯丁烷）。 11.將盤子放進蛋白質測序儀的反應容器中，使用含 2 mmol/L 磷酸鈉的甲醇-水 (9:1) 溶液。用 ATZ 收集程序進行標準的 Edman 測序。 這樣將直接把最后的 ATZ 產物和 32P 標記的磷酸送入分段收集器。可以改進該程序，以便達到最佳的遞送試劑和溶劑的時間。含水的甲醇比氯丁烷具有更髙的黏性，所以傳送時間需要更長。更「精確」的儀器型號還會有確保遞送正確進行的傳感器，但不論怎樣，一定要確保完善的試劑遞送效果。 12.在計數器中對溶于閃爍液的部分收集器中的樣品進行計數。 在這里最好使用閃爍液。它大約可使放射性活性增大一倍，盡管背景也會相應地增高，但目前還沒有很好的方法提高信噪比。 13.檢查 Edman 降解的效率，從測序儀反應器中取出盤子，晾干，再在閃爍計數器上檢查殘留的放射性水平。 通常會剩下 10%~20% 的初始量，這主要取決于殘基數和測序儀的長度，可歸因于每一降解循環中正常的循環收率和累積的阻斷情況。 展開 | 