蛋白質紫外吸收與濃度測定方法

[原理]

由于蛋白質中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白質溶液在280nm處具有紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內，蛋白質溶液在此波長處的吸光度與其濃度呈正比關系，因此利用這一性質可進行蛋白質定量測定。

該法迅速、簡便、不消耗樣品、低濃度鹽類不干擾測定，可測定0.1～1.0mg/mL的蛋白質溶液。

由于蛋白質的紫外吸收高峰常因pH變化而改變，故應用此法時要注意溶液的pH。最好樣品的pH與標準曲線制定時的pH一致。

本法對于測定與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質誤差較大，故適用于測定與標準蛋白質酪氨酸、色氨酸這類氨基酸含量相仿的樣品；若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質，會出現較大干擾。

例如混有核酸，核酸可吸收波長為280nm的紫外光，但它對260nm紫外光吸收更強。而蛋白質恰恰相反，280nm的紫外吸收值大于260nm紫外吸收值。運用280/260吸收差法則可以適當校正核酸對蛋白質濃度測定的干擾作用。

[方法與步驟]

1、標準曲線的制作

取7支試管，編號后按下表依次加入標準蛋白溶液和氫氧化鈉溶液。

 

加畢，攪勻，選用石英比色皿，用紫外 分光光度計    測A280。

以每管標準蛋白毫克數為橫坐標，對應的A280值為縱坐標，作標準曲線圖。

2、蛋白樣品測定

（1）標準曲線法

實驗中樣品可用牛奶中自制的酪蛋白溶液加0.1mol/L NaOH稀釋而成。

把樣品蛋白溶液裝入石英 比色皿 中，測A280，對照標準曲線求得蛋白質濃度。

式中 n——從標準曲線上查出的酪蛋白毫克數。

（2）280nm與260nm吸收差法：

分別測定蛋白質樣品在280nm、260nm處的吸收值，按下列公式計算蛋白質質量濃度。

蛋白質質量濃度（mg/ mL）=1.45 A280 - 0.74 A260式中 A280——蛋白質溶液在280nm出測得的吸光度；A260——蛋白質溶液在260nm出測得的吸光度。不同蛋白質及核酸的光吸收率不完全相同，按此式計算仍可能產生誤差。