為了進行體外(in vitro)研究，必須先將目的蛋白質從其他細胞組分中分離提純出來。這一過程通常從細胞裂解開始（對于分泌性蛋白質的提純則不需要裂解細胞），通過破壞細胞膜將細胞內含物釋放到溶液中，從而獲得含有目的蛋白質的細胞裂解液。然后通過超速離心將細胞裂解液中膜脂和膜蛋白、細胞器、核酸以及含有可溶蛋白質的混合物分離出來。鹽析法是一種較為常用的通過沉淀從裂解液中分離濃縮蛋白質的方法。基于目的蛋白質的化學性質（如分子量、帶電情況和結合活性），可以利用不同的色譜法來進一步分離提純蛋白質。純化的程度可以用電泳（已知目的蛋白質的分子量）、光譜學（目的蛋白質具有獨特的光譜學特征）或者酶活分析反應（目的蛋白質具有特定的酶活性）來衡量。另外，蛋白質可以使用電聚焦根據其電荷被分離 [36]。
對于天然蛋白質，可能需要一系列的純化步驟才能獲得純度足以用于實驗室應用的蛋白質。為了簡化這一過程，通常采用基因工程的手段在目的蛋白質上添加一些化學特性，在不改變其結構和生物學活性的情況下使純化過程更為簡單。通常是將含有特定氨基酸序列的“標簽”連接在目的蛋白質的N-端或C-端。例如，含有連續多個組氨酸的序列，稱為組氨酸標簽；將含有帶組氨酸標簽蛋白質的裂解液流過含有鎳的親和層析柱，組氨酸就可以與鎳螯合從而結合在柱子上，而裂解液中其他蛋白質由于沒有組氨酸標簽而直接流出柱子，從而達到分離目的。[37]通過基因工程（即DNA重組）改造而獲得的蛋白質被稱為重組蛋白質。