LY: 宋體; mso-ascii-font-family: 'Times New Roman'; mso-hansi-font-family: 'Times New Roman'">融合蛋白進行Far Western印跡來檢測蛋白質-蛋白質相互作用
放射標記蛋白探針的制備
1．在微量離心管中制備下列反應混合物：
[γ-32P] ATP（6000 Ci/mmol） 5μl
蛋白激酶A 1 unit/μl
在谷胱甘肽瓊脂糖上的GST融合蛋白 1～3μg
2×PK緩沖液 12.5μl
水 到25μl
反應混合物在37℃孵育30 min。
2．標記反應完成后，加入200μl的1×PK緩沖液到離心管中清洗瓊脂糖珠，然后在微量離心機上以最大速度離心1 min。用適當的方式將含游離放射性核酸的上清棄去，再重復清洗一次。
3．用一種蛋白酶切下標記蛋白質，或用20mmol/L還原型谷胱甘肽于50mmol/L Tris (pH8.0)中，將標記GST融合蛋白從瓊脂糖珠上洗下。將標記蛋白存放在冰盒中，在同一天中使用。
4．在標記反應前如果標記蛋白與GST成分分開，就將標記蛋白上用1×PK緩沖液平衡的Sephadex G-50柱，以除去游離的標記核酸。探針蛋白一旦與游離核酸分開，就可使用。將標記蛋白放在冰盒中，在同一天使用。
探測膜
5．用標準技術將蛋白質轉移到膜上，制備待檢測的膜。
6．用堿性緩沖液完全覆蓋膜并在4℃輕輕振蕩清洗10min。
7．棄去堿性緩沖液，用封閉緩沖液完全覆蓋膜，并在4℃輕輕振蕩孵育4 h過夜。