蛋白質DNA相互作用的甲基化和尿嘧啶干擾分析法—甲基化

在甲基化干擾實驗中，探針通過將鳥嘌呤N-7及腺嘌呤N-3位用硫酸二甲酯 (DMS)進行甲基化而產生。這些甲基化的堿基可被哌啶特異性切割。

含有蛋白質結合位點的DNA片段

TE 緩沖液 pH 7.5 ?8.0硫酸二甲酯（DMS)DMS反應緩沖液DMS終止緩沖液10 mg mL tRNA 溶液0.3 mol L 乙酸鈉1 mmol L EDTA pH 5. 21 mol L哌啶（從10 mol L哌啶儲液稀釋）終止 加樣染液 儀器與耗材：水浴鍋

水浴鍋

1) 制備單末端標記的DNA探針。

2) 取約10⁶ cpm的探針溶于5?10μL TE緩沖液中。加入200μL DMS反應緩沖液及 1μl DMS。在禍旋混合器上充分混勻。室溫溫育5 min。

注意：DMS是一種強毒性物質，必須在通風櫥內小心操作。含有DMS的液體應倒在指定的 DMS廢液瓶中，接觸過DMS的吸液頭應放入一個專門的DMS固體廢物瓶中，由安全部門處理。

3) 在探針混合液中加入以下試劑：40μL DMS終止緩沖液、1μL 10 mg/mL tRNA 溶液、600μL 100% 乙醇。混勻后置于干冰/乙醇浴中10 min。微量離心機4℃以最大速度離心10 min。用延長的巴斯德吸管小心吸出上清，置于液體DMS廢液瓶中。

4) 將沉淀重懸于250μL 0. 3 mol/L乙酸鈉、1 mmol/L EDTA中，放置在冰上。加入750μL 100%乙醇，混勻，如步驟3 —樣用乙醇沉淀DNA。

5) 按步驟4重復乙醇沉淀DNA 1次。用70%乙醇洗DNA沉淀1次，離心10 min。小心除去上清，將管子倒扣在吸水紙上，在空氣中晾干10 min。

6) 在閃爍計數儀上測量DNA沉淀的契侖科夫計數，計算其cpm值。用TE緩沖液重 懸至約 20 000 cpm/μL。

7) 用優化的DNA結合條件，如同基本方案步驟9建立一個反應體系，但反應體積放大約5倍（50μL體積中用10⁵ cpm探針）。

8) 將結合反應液加入3個非變性聚丙烯酰胺凝膠樣品孔中。按遷移率變動分析法的條件對其進行電泳。

9) 將凝膠進行放射自顯影，切出相應于蛋白質-DNA結合物及非結合探針的顯影帶，用電洗脫的方法從膠中將DNA純化至DEAE膜上。

10) 用100μL 1 mol/L哌啶重懸沉淀。置于90?95°C水浴中，在管子上加上一玻璃板以防蓋子沖開。小心將管子從水浴中取出，置于干冰上。

11) 在蓋子上用大注射器針頭扎孔，在真空蒸發器（如Speed- vac)中凍干1 h或直至完全凍干。加100μL蒸餾水。再次冷凍和凍干。重復加水，冷凍和凍干。切倫科夫計數并測定樣品的cpm值。

12) 在沉淀中加足夠的終止/加樣染液，濃度以1?2μL體積中含有需加樣的樣品量為宜（3000 cpm足以自顯影過夜）。95°C加熱5 min，迅速置于冰上冷卻。

13) 將非結合探針及蛋白質-DNA結合物加于6%或8%的聚丙驗的烯酰胺/尿素測序膠上。同測序膠一樣進行電泳及放射自干擾的鳥嘌呤和腺嘌呤用顯影。加樣的DNA-蛋白質結合物及非結合探針的計數值相等，以便對不同的樣品進行精確的比較。