一、灌制平板膠1.清洗玻璃板。a.將玻璃板放人 2%PCC-54 清洗液中浸泡 3?24 h。 b.自來水徹底沖洗玻璃板后，再用蒸餾水清洗一遍。 c.玻璃板用干凈紙巾擦干后，再用浸過甲醇的 Kunwipes 紙巾擦拭，空氣中晾干。 2.安裝凝膠模具組件。a.將間隔片放在兩塊玻璃板之間形成三明治模式，用夾子夾好。 b.調整玻璃板和間隔片的底部，使之處于同一水平面，夾緊夾子。 c.把 b 中做好的凝膠三明治夾板放到模具架上。 d.插人 Teflon 樣品梳，在低于梳齒底部約 1.0?1.5 cm 處做好標記在此以 Proteannxielectrophoresisunit(Bio-Rad) 為例說明凝膠模具組件安裝過程。安裝完成后的照片見圖 2.6a?f。 3.灌制分離膠。a.參考表 2.2(見本章引言）確定所用的丙烯醜胺濃度。 b.按照表 2.4 的配方配制合適的分離膠。在加 TEMED 之前應確保溶液已經充分混勻。 c.用 IOml 移液器將混合好的溶液加入玻璃板夾層中至標記線高度 (步驟②d 中做好的標記線）（見圖 2.6)。 d.小心地在凝膠上覆蓋一層約 2 mm 高的水或水飽和的正丁醇或異丙醇溶液。這是為了防止空氣與凝膠接觸后抑制凝膠的聚合，并保證凝膠表面水平。 e.聚合完全后（約需 30 min)，倒掉凝膠上層的水，用濾紙仔細將剩余的水吸干，注意勿破壞凝膠表面。如果凝膠上層鋪的是正丁醇（或異丙醇），將液體吸干后，應用水沖洗凝膠表面。 若在凝膠和上層液相之間可看見一清晰的折射率變化，則說明凝膠已經聚合。
 4.灌制濃縮膠。a.為濃縮膠選擇一合適的丙烯酰胺濃度，按表 2.5 的配方依次混勻各成分。 b.在分離膠上鋪濃縮膠至濃縮膠高度為 2.0?3.0 cm。 c.將梳子插入鋪好的濃縮膠溶液，保持梳齒底部與分離膠上沿距離 1.0~1.5 cm，注意梳齒下面不應有氣泡藏匿。以一定角度將梳子插入濃縮膠能減少氣泡產生的可能性。若有氣泡形成，可輕拍氣泡周圍的玻璃板將氣泡排出。 d.讓濃縮膠聚合約 2 h。梳子邊緣的折射率變化表明膠已經制備好。這時最好在玻璃板上對應樣品孔底部用記號筆做好標記。
 5.小心地拔出梳子，按廠商給出的說明將凝膠模具安裝到電泳裝置內。6.將電泳緩沖液倒入上槽，并確保緩沖液沒過上樣孔，從槽上方檢查有無滲漏。如果沒有滲漏，在下槽中也加人電泳緩沖液，傾斜整個裝置以趕出凝膠下面可能留有的氣泡。 另一種排除氣泡的做法是用一根長的彎針或鉤狀的巴氏吸管在吸取電泳緩沖液后噴向凝膠底部邊緣。排完氣泡后就可以上樣了。 二、樣品的制備進行步驟7或步驟8。 7.制備蛋白溶液。a.將蛋白質溶液和 2XSDS-PAGE 上樣緩沖液以 I:1 混合。在理想情況下，SDS 和多肽結合的比例是每克多肽 1.4 gSDS，但為了保證有足夠量的 SDS，蛋白質的終濃度不應高于 10jug/julD 實驗提示：將整個樣品都上樣時，切記樣品的體積（也就是蛋白質溶液和上樣緩沖液的總體積）不要超過上樣孔的容積。 b.用電加熱塊（heatblock) 或水浴裝置加熱樣品，95°C 保持 2 min，使蛋白質變性，并確保蛋白結合最大量的 SDS。樣品冷卻至室溫后，離心去除不溶物。 8.制備細胞總蛋白樣品。a.渦旋制備好的細胞團塊使之松散。 b.直接加人 2XSDS-PAGE 上樣緩沖液，渦旋混合。 這時的細胞裂解液相當黏稠。加人的上樣緩沖液的量取決于所研究的細胞株。但一般以每 IXlO5 個細胞用 IOOpl 為宜。最佳使用量還需試驗決定。 實驗提示：將整個樣品都上樣時，切記樣品的體積（也就是蛋白質溶液和上樣緩沖液的總體積）不要超過上樣孔的容積。 C.將細胞裂解液于 IOOOOOg 離心 2 〇 min，收集上清。 從一定數目的細胞中得到的蛋白質濃度會因采用的細胞株不同而有所差異。如果蛋白濃度超過 lOyg/rl，應直接加 SDS 粉末，即使終濃度為 5% 的 SDS 也不會干擾電泳分離。 d.用加熱塊或水浴裝置加熱樣品，95。(：保持 2 min，使蛋白質變性，并確保蛋白結合最大量的 SDS。樣品冷卻至室溫后，離心去除不溶物。 三、進行不連續平板凝膠電泳9.使用移液器和上樣吸頭將樣品加人上樣孔中。10.將電泳裝置與電源連接，正極接下槽、負極接上槽。11.接通冷卻系統保持 8°C，維持恒壓 200V，或者在室溫維持恒壓 90V 直至溴酚藍前沿到達凝膠底部。這需要 6?8 h(恒壓 200V) 或 16?18 h(恒壓 90V)。12.關閉電源，斷開電極。從裝置中取出凝膠板，小心移去間隔片。用間隔片輕輕撬開凝膠板，讓凝膠附著在其中一塊板上。13.選用一種合適而靈敏的染色方法使蛋白質顯現。若要采用與蛋白質的質譜鑒定兼容的染色方法，參見方案 2(考馬斯亮藍染色）和方案 7(銀染）
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