血漿清蛋白的分離純化與鑒定

實驗概要

1．掌握蛋白質的分離技術

2．掌握分段鹽析、凝膠層析及蛋白質醋酸纖維薄膜電泳的原理及操作方法

3．掌握電泳方法檢測分離效果

實驗原理

          不同的蛋白質的分子量、溶解度、以及在一定條件下帶電的情況有所不同，可以更據這些性質的差別，分離及提純各種蛋白質。利用硫酸銨分段鹽析法將血清中的清蛋白及球蛋白分離，清蛋白液再利用葡聚糖凝膠過濾法除鹽，即可得到較純的清蛋白。純化后的清蛋白可利用醋酸纖維薄膜電泳法鑒定其純度。          鹽析：是指將中性鹽（如硫酸銨）加入蛋白質溶液中，中和Pr蛋白質表面電荷及破壞水化膜，使蛋白質相互聚集在析出。分段鹽析：各種蛋白質鹽析時所需的鹽濃度和PH不同，利用不同鹽濃度下Pr溶解度不同，將蛋白質分段沉淀下來。半飽和硫酸銨沉淀血清中球蛋白（清蛋白溶解）將血清清蛋白和球蛋白初步分離。          常用的除鹽方法：半透膜透析；凝膠過濾（層析）。在葡聚糖凝膠層析柱中，由于蛋白質和鹽的分子量不同，洗脫速度也不同，大分子蛋白質不能進入凝膠的網孔內而先流出，小分子鹽則可進入網孔滯留在凝膠內，收集蛋白洗脫液，即可得到脫鹽的蛋白質。用三氯醋酸液鑒定洗脫的蛋白液，以BaCL₂檢測硫酸銨。         純化后的清蛋白用醋酸纖維薄膜電泳鑒定蛋白質分離效果。

主要試劑

1．飽和硫酸溶液：稱固體硫酸銨85g于100ml蒸餾水中，在70～80℃水浴中攪拌溶解，用濃氨水調PH為7.2，室溫放置過夜，瓶底析出白色結晶，上
      層液即為飽和硫酸銨液。
2．生理鹽水：稱取分析純NaCl 0.89克，蒸餾水稀釋至1000ml.
3．葡聚糖凝膠Sephadex G-25: 稱取10克Sephadex G-25，加入200ml 0.02mol/lPH6.5磷酸鹽緩沖液溶脹24小時。

4．10％三氯醋酸。
5．1％氯化鋇溶液

6．pH8.6，離子強度0.06巴比妥電極緩沖液：稱取巴比妥鈉12.76g，巴比妥1.66g，蒸餾水加熱溶解后再加水至1000ml。
7．氨基黑10B染色液：稱取氨基黑10B 0.5g，用甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸餾水40ml溶解。
8．漂洗液：95％乙醇45ml，加冰醋酸5ml及蒸餾水50ml。

主要設備

1．電泳儀、電泳槽
2．電動離心機、層析柱
3．鑷子、培養皿、X光軟片、濾紙
4．離心管、燒杯、量筒、滴管、小試管、吸管

實驗步驟

1．鹽析沉淀血清球蛋白

        取離心管1支，加入鹽析用蛋白質溶液3ml（血漿1ml和生理鹽水2ml），再逐滴加入pH7.2飽和硫酸銨液3.0ml，充分搖勻。靜置20分鐘后離心（3000rpm×10分），取上清液（此液中主要含清蛋白）備用。

2．凝膠層析脫鹽 

      （1）裝柱：取層析柱（1×500px）,關緊下端出口，加蒸餾水少許，緩慢加已膨脹的葡聚糖凝膠G-25懸液，至凝膠沉淀10～375px高，注意凝膠床表面應平整。

       （2）上樣與洗脫：小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降到凝膠床表面，關緊下端出口。取1ml上清液（清蛋白液），小心緩慢地加到凝膠床表面上，注意不要破壞凝膠床表面的平整。打開下端出口，使樣品進入凝膠床，小心加入少許蒸餾水于柱內，以洗凈柱內壁上的樣品溶液，然后可加入多量的蒸餾水進行洗脫。流速為20滴/分。

      （3）收集：事先應準備好15支小試管，于加樣后開始立即收集洗脫液。每收集約1ml換一管。 檢查：按洗脫液的管號順序每管取出一半，各加10％三氯醋酸5滴，出現白色混濁或沉淀者即有蛋白質存在；取對應沉淀最多的收集管溶液用著電泳鑒定。

      （4） 繼續用蒸餾水洗柱，流出液用1%BaCl液檢測，直至無白色沉淀出現后，洗柱完畢，關閉出口。

3．醋酸纖維薄膜電泳鑒定蛋白質分離效果

      （1）取2×200px大小的醋酸纖維薄膜2張，于巴比妥緩沖液中充分浸濕。將浸濕的膜條取出后用濾紙吸去多余的水分，于無光澤面點樣。 

      （2）在距離膜條一端約37.5px處，用X光軟片蘸取全血清和純化的清蛋白樣品液分別點于兩張膜條上。 

      （3）將巴比妥電極緩沖液加于電泳槽內，再將點樣后的膜條放置于電泳槽架上，槽架上用四層濾紙作橋墊。放置時膜條的無光澤面應向下，點樣端置于陰極，膜條與濾紙面貼緊。

      （4）接通電源，以150V恒壓電泳約45分鐘。

      （5）通電完畢后，用鑷子將膜條取出，浸于盛有氨基黑10B的染色液中染色液中，染色5～10分鐘取出，立即浸入盛有漂洗液的培養皿中，反復漂洗數次，直至背景漂凈為止。用濾紙吸干膜條，觀察電泳圖譜中蛋白質區帶，并與全血清蛋白質的電泳圖譜作比較。