血圖片染色顯微鏡檢查是血液細胞形態學檢查的基本方法,主要用于紅細胞、白細胞、血小板形態等檢查,還可以用于白細胞、血小板的數量評估。在臨床應用極為廣泛,特別是對于各種血液病的診斷和鑒別診斷,具有重要價值。如果血圖片制備不良,染色不佳,常使血細胞的形態學鑒別和診斷發生困難,甚至導致錯誤的結論。如果血膜過厚則使細胞重疊縮小,血膜太薄易導致細胞分布不勻,白細胞多集中于邊緣。因此,制備厚薄適宜、頭體尾分明、染色良好的血涂片,是血細胞形態學檢查最基本的要求,必須以認真負責的態度注意操作過程中的每一個環節。
1.載玻片的清潔 新購置的載玻片常帶有游離堿質,必須用濃度約1mol/L HCL 浸泡24小時后,再用清水徹底沖洗,干燥后備用。用過的載玻片可放入適量肥皂或其他洗滌劑的清水中煮沸20分鐘,趁熱將血膜刷洗干凈,再用清水反復沖洗,必要時用蒸餾水最后浸洗后干燥備用。使用載玻片時,切勿用手觸及撥片表面,以保持玻片清潔誒、干燥、中性、無油漬。
2.血圖片制備 血圖片的制備方法很多,有手工推片法、載玻片壓拉法及棕黃層涂片法等。血液涂片既可直接用非抗凝的靜脈血或毛細血管血,也可以用經EDTA抗凝的血液制備。由于EDTA能阻止血小板聚集,顯微鏡下觀察血小板形態時長采用,但EDTA抗凝血有時能引起紅細胞皺縮和白細胞聚集,因此最好使用非抗凝血制備血涂片。一張好的血涂片,要求厚薄適宜、頭體尾分明、邊緣整齊、兩側應留有空隙。
臨床上用的普通手工推片法是取血標本一滴置載玻片的一端,從血滴前沿方向接觸血液,使血液沿方向接觸血液,使血液沿推片散開,通常推片與載玻片保持30度~45度夾角,平穩地向前推動,血液即在載玻片上形成薄層血膜。圖片侯寶與血滴大小、推片與載玻片間夾角、推片速度、血細胞比容有關。
一般認為:血滴大、角度大、速度快則血膜越厚;反之則血膜越薄。血膜分布不均主要是推片邊緣不齊、用力不勻和載玻片不清潔所致。血細胞比容高于正常時,血液粘度較高,保持較小的角度,可得滿意結果;相反,血細胞比容低于正常時,血液較稀薄,則用較大角度。
血細胞常用的染色方法
血涂片染色是為了使血細胞著色,燃料將細胞的胞膜、胞質、胞核等染成不同的顏色,便于在顯微鏡下觀察識別,根據細胞體積大小、染色深淺、顆粒的大小和顏色等特點對細胞進行判斷。常用的染色方法:瑞士染色法、吉姆薩染色法和瑞士-吉姆薩復合染色法。
瑞士染色法:
瑞氏染料:由酸性染料伊紅(E-)和堿性染料亞甲藍(M+)組成。將適量伊紅、美藍溶解在甲醇中,即為瑞氏染料。甲醇的作用:一是溶解美藍和伊紅;二是固定細胞形態。
染色原理:
既有物理的吸附作用,又有化學的親和作用。各種細胞成分化學性質不同,對各種染料的親和力也不一樣。如血紅蛋白、嗜酸性顆粒為堿性蛋白質,與酸性染料伊紅結合,染粉紅色,稱為嗜酸性物質;細胞核蛋白、淋巴細胞、嗜堿性粒細胞胞質為酸性,與堿性染料美藍或天青結合,染紫藍色或藍色,稱為嗜堿性物質。
中性顆粒呈等電狀態與伊紅和美藍均可結合,染淡紫紅色,稱為嗜中性物質;原始紅細胞、早幼紅細胞胞質、核仁含較多酸性物質,染成較濃厚的藍色;中幼紅細胞既含酸性物質,又含堿性物質,染成紅藍色或灰紅色;完全成熟紅細胞,酸性物質徹底消失后,染成粉紅色。
吉姆薩染色法:
染色原理與瑞士染色法大致相同。吉姆薩染料由天青和伊紅組成。本法對細胞核和寄生蟲著色較好,結構顯示更為清晰,但細胞質和顆粒著色較差。
瑞士-吉姆薩符合染色法:
為兼顧瑞士染液的兩者之長,將瑞士染粉和吉氏染粉混合,用甲醇溶解即瑞-吉液,用瑞-吉液進行染色,使血細胞的顆粒及細胞核均能獲得滿意的染色效果。