血清總膽紅素和結合膽紅素測定實驗

一、實驗試劑；

1. 咖啡因一蘋果酸鈉試劑，稱取無水醋酸鈉41.0g（CH3COONa·3H2O6 3.0g）苯甲酸鈉38.0g，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA Na2）0.5g，溶于500ml蒸餾水中，再加入咖啡因25.0g攪拌使溶解（加入咖啡因后不發生加熱溶解），用蒸餾水補足1升，混勻，用濾紙過濾，置棕色瓶，室溫保存。

2. 堿性酒石酸鈉溶液：稱取氫氧化鈉75g酒石酸鈉（Na2C4H4O6·2H2O）263.0g用蒸餾水溶解并補足至1升，混勻。置塑料瓶中，室溫保存。

3. 5.0g/L亞硝酸鈉溶液：稱取亞硝酸鈉（NaNO2）5.0g，用蒸餾水溶解并稀釋至100毫升，混勻，貯棕色瓶中，置冰箱保存，穩定不少于3個月，作10倍稀釋成50g/L，貯存冰箱，穩定不少于2周。

4. 50g/L對氨基苯磺酸溶液：稱取對氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g溶于800ml蒸餾水中加人濃HCl 15ml，用蒸餾水補足至1升。

5. 重氮試劑：臨用前取5.0g/L亞硝酸鈉溶液 0.5ml和5.0g/L對氨基苯磺酸溶液，20ml混合。6. 50g／L疊氮鈉溶液：稱取疊氮鈉059以蒸餾水溶解并稀釋至100毫升。

7. 膽紅素標準液：171umol/dL(10ml/dL)準確稱取符合要求的膽紅素10mg加人1ml二甲亞礬，用玻璃攪拌，使成混懸液，加入 0.05 mol／L碳酸鈉溶液2ml使膽紅素完全溶解。移入100容量瓶中，用稀釋液同血清洗滌數次并入容量瓶中，緩慢加入0.1mol/L鹽酸2ml邊加邊搖（勿用力搖，以免產生氣泡），最后以稀釋同血清補足300ml，配制過程中應避光，貯存容器，用黑紙包裹，置4℃冰箱3天內有效，要求配后盡快做標準曲線。

二、實驗操作；

充分混合后波長600nm，對照管調零，讀取各管光密度，或用水調零。讀取測定管及對照管吸光度，用測定管吸光度與對照管吸光度之差值（Au-Ac）在標準曲線上畫出相應的膽紅素濃度。

標準曲線的制作，按下表稀釋膽紅素貯存液不同濃度

將以上各管充分混勻（但不可產生氣泡），按血清總膽紅素測定法操作，每一濃度作3個平行管，每一濃度分別作標準對照管，用各自的標準對照管調零。讀取各管標準管的吸光度，每管還應減去稀釋用血清的總膽紅素的吸光度，然后與相應的膽紅素濃度繪制標準曲線。

參考值：血清總膽紅素5.1-19.0 umol/L（0.3-1.1mg/dL）

血清結合膽紅素（1分鐘）1.7--6.8 umol/L（0.1-0.4mg/dL）

l. 本法測定血清總膽紅素在10-37℃條件下，不變溫度變化德影響，顯色在2小時內非常穩定。

2. 本法靈敏度高（摩爾吸光度系數為74380±866L·mol-1·cm-1）且可避免其他有色物質的干擾。

3. 輕度溶血對本法無影響，但嚴重溶血可使測定結果偏低。

4. 用疊氮鈉作防滴劑的質控血清，可引起偶氮反應不完全，甚至不顯色。

5. 膽紅素對光敏感，標準及標本均應盡量避光。

6. 脂血對腸溶色素對測定有干擾，應盡量取空腹血。

7. 膽紅素大于100mg/L的標本可減少標本用量，或用生理鹽水稀釋后重做。