利用不同容量的角式轉頭及很容易配制的梯度液,在各種型號的超速離心機上都能得到滿意的分離結果。下面舉了幾個分離實例,實際上還可以應用于各種型號各種容量的固定角式轉頭。
(一) 梯度液
A液:11.40gNacl,0.1g EDTA-Na2,置于1000ml量筒中加入500ml重蒸水及1
ml 1N NaOH,混勻至全部溶解。加重蒸水至1000ml最后再加3ml重蒸水(Nacl:0.195mol)。終密度1.006g/cm3,PH10.37。
B液:加24.98g NaBr 到100ml A液中。終密度1.182g/cm3。(Nacl:0.195mol, NaBr:7.65mol),PH9.72。
C液:加78.32g NaBr 到100ml A液中。終密度1.478g/cm3。(Nacl:0.195mol, NaBr:7.65mol),PH8.86。
(二) 離心機及轉頭
? 離心機:Hitachi CP-MX系列超速離心機或其他類似機組。
Hitachi CS-150GXL微量超速離心機。
? 轉頭,離心管;S 140 AT:140,000rpm,1,050,000×g,10×2ml,K=5,1PC厚壁管。
S 80 AT3:80,000rpm,415,000×g,8×8ml,K=23,6PC厚壁管。
S 70 AT:70,000rpm,505,000×g,8×40ml,K=44,40PA管。
(三) 血漿-血球分離:
全血,角轉頭或甩平轉頭3000rpm×20min,沉淀為血細胞,上清血漿待用。
(四) 乳糜粒分離:
? 離心參數:各種轉頭均可用,4×106(g×min),10℃
? 梯度液:離心管下部3/4容積為血漿,上部1/4容積為0.15MNacl+0.3MEDTA。PH7.4。
? 離心結果:乳糜粒上浮,離心管傾斜,吸管貼管壁慢吸出(約占血漿容積的2~6%。禁令12小時以上供血者血漿中乳糜含量很低,食后供血者含量較高。
(五) 血清脂蛋白分離:
(ⅰ)VLDL分離(ρ<1.006g/cm3)
轉頭 | 離心管內液體分布 | 離心參數 | 結果 |
S140AT (CS-150GXL機組) | 下部600μl血漿 上部300μl A液 | 140,000rpm×50min 16℃ 加速:5 減速:7 | 可見明顯分層上部約1/3VLDL吸出 |
S80AT3 (CS-150GXL機組) | 下部3.4ml血漿 上部1.7mlA液 | 80,000rpm×4.5hrs 16℃ 加速:5 減速:7 | 同上 |
P70AT (CP-MX機組) | 下部24ml血漿 上部11.7ml A液 | 70,000rpm×8hrs 16℃ 加速:5 減速:7 | 同上 |
(ⅱ)LDL(含IDL)分離(1.006g/cm3<ρ<1.063g/cm3)
轉頭 | 離心管內液體分布 | 離心參數 | 結果 |
S140AT (CS-150GXL機組) | 第一次離心后上部VLDL取出,下部600μl移入另一離心管,加入300μl B液,充分混合 | 140,000rpm×80min 16℃ 加速:9 減速:7 | 上部1/3體積LDL+IDL吸出 |
S80AT3 (CS-150GXL) | 第一次離心后上部VLDL吸出,,下部3.4ml移入另一離心管,加入1.7ml B液并充分混合 | 80,000rpm×5.5hrs 16℃ 加速:9減速:7 | 同上 |
P70AT (CP-MX系列超速機或類似機型) | 第一次離心后上部11.7ml吸出,下部約24ml 移入另一離心管,加入11.7ml B液,充分混合 | 70,000rpm×10hrs 16℃ 加速:9 減速:6 | 同上 |
(ⅲ)HDL分離(1.063g/cm3<ρ<1.21g/cm3)
轉頭 | 離心管內液體分布 | 離心參數 | 結果 |
S140AT (CS-150GXL機組) | 第二次離心后吸出上部300μl后,下部600μl移入另一離心管,加入300μl C液,充分混合 | 140,000rpm×140min 16℃ 加速:9 減速:7 | 可見較明顯分層, 上部為HDL,下部為血清白蛋白及球蛋白 |
S80AT3 (CS-150GXL機組) | 第二次離心后吸出上部約1.7ml、下部3.4ml移入另一離心管,加入1.7ml C液,充分混合 | 80,000rpm×8小時 16℃ 加速:9 減速:7 | 同上 |
P70AT (CP-MX系列機或其他類型機組) | 第二次離心后吸出上部1/3、下部2/3移入另一離心管,加入約12ml C液,充分混合 | 70,000rpm×15小時 16℃ 加速:9 減速:6 | 同上 |
(本文部分實驗由上海長海醫院 賈鳳玉完成)
參考文獻
(1) 余興明:“血清脂蛋白的離心分離技術”,“生命的化學”,1997.3
(2) Hitachi KoKi:“himac Application’,No:89,1999.7 No:103,2000.10