實驗原理
血涂片及骨髓片是通過特定的方法將血液或骨髓按一定方向均勻涂開的過程,微觀上是使細胞由球形變為平面形或近平面形平鋪在載玻片上。
瑞氏染液中酸性伊紅與細胞中的堿性物質如血紅蛋白、嗜酸性顆粒結合;堿性染料亞甲藍(轉變為天青B)與細胞中的酸性物質如核染色質、淋巴細胞胞漿、血小板結合。天青B和伊紅結合在適宜條件下形成紫色的天青B-伊紅復合物,結果使中性粒細胞的顆粒及血小板顆粒區成紫色。
實驗方法
材料:
玻片、推片、瑞氏染液、磷酸鹽緩沖液(pH:6.4-6.8)、顯微鏡。
方法:
1.消毒取血或者骨髓。
2.準備干凈玻片及取邊緣光滑的載片做推片。
3.取小綠豆大小的血滴或者骨髓液置于玻片的一端,將推片一端置于血滴前方,向后移動到接觸血滴,使血液均勻分散在推片與載片的接觸處。然后使推片與載片呈30°~40°角,向另一端平穩地推出,以一定均勻的速度向前滑動,涂片推好后,迅速在空氣中搖,使之自然干燥。
4.瑞氏染色:用蠟筆在血膜兩頭劃線,平放于染色架上;加瑞氏染液覆蓋血膜,固定1min;滴加等量或稍多的緩沖液,混勻,染色5-10分鐘;用清水沖洗,待干后鏡檢。
實驗結果計算
1.一張良好的血片/骨髓片,要求厚薄適宜,頭體尾分明,分布均勻,邊緣整齊,兩側留有空隙。
2.染色后,PH適中則紅細胞呈粉紅色;PH偏堿則紅細胞呈藍色;PH偏酸則紅細胞呈橘紅色。
注意事項
1.玻片的清洗:新玻片常有游離堿質,因此應用清洗液或10%鹽酸浸泡24h,然后再徹底清洗。用過的玻片可放入適量肥皂水或合成洗滌劑的清水中煮沸20min,再用熱水將肥皂和血膜洗去,用自來水反復沖洗,必要時再置95%乙醇中浸泡1h,然后擦干或烤干備用。
2.使用玻片時只能手持玻片邊緣,切勿觸及玻片表面,以保持玻片清潔,干燥,中性、無油膩。
3.血滴或者骨髓液置玻片上后立即涂片,否則容易凝固,影響效果。
4.血片制好后最好立即固定染色,以免細胞溶解和發生退行性變。
5.血膜未干透,細胞尚未牢固附在玻片上,在染色過程中容易脫落,因此血膜必需充分干燥。
6.因骨髓中含骨髓小粒和脂肪,有核細胞數量較多,較血液粘稠,再推片時角度應小些,速度要慢些,推片與玻片夾角大,血膜就厚,小則薄。
7.推片速度應該適中,速度過快,涂片就會過厚,速度太慢,則太薄。
8.染色時間與染液濃度、室溫及細胞多少有關,一般染液淡、染色時間長些效果好。
9.染液不能過少,以防蒸發沉淀。
10.沖洗時不能先倒掉染液,應以流水沖,防染料沉著。沖洗時間也不能長。
11.染色過淡,可復染,染色過深可用水沖洗或浸泡,還可用甲醇脫色。
12.染色時不要一次性將所有玻片染完,應留有涂片以備加做其他檢查之需。
13.做骨髓涂片檢查應制片至少6-10張,全部送檢,,以備其他檢查所用,血膜未干前不能相互疊