熒光檢測
按照表1的參數用SpectraMax i3x多功能微孔板讀板機檢測樣本的熒光值。在初步掃描中，氧化鐵納米顆粒對照和包被樣本以260 nm激發，以5 nm 步進在295nm至750 nm范圍掃描發射光譜。氧化鋅納米顆粒樣本則以350 nm 激發，5 nm 步進在375 nm至750 nm范圍掃描發射光譜(表1)。讀板前微孔板以回旋振蕩方式高速振蕩5秒鐘。完成初步驗證后，按照用戶定義的激發光和發射光范圍使用光譜優化向導(Spectral Optimization Wizard，SOW)進行一系列的熒光值讀取，并獲得每個樣本的最佳波長組合。SOW可按照表2的設定進行初始化。點擊Read后會彈出一個新的對話框讓用戶確定激發和發射波長的測試范圍。此次實驗中激發波長的掃描范圍為250到500 nm，發射波長范圍為300到700 nm。對于氧化鐵納米顆粒樣本，掃描步進為10 nm。對于氧化鋅納米顆粒樣本掃描步進則為5 nm。對所有的樣本讀取高度為默認1 mm。參數對話框參見圖2。
數據采集
光譜優化向導旨在識別樣本的最佳激發和發射波長組合并以此為基礎進行后續的檢測。軟件本身不會自動保存分析熱圖和相關熒光值數據。但是，我們可以在熱圖窗口打開的情況下，右擊熱圖，選擇復制原始數據(Copy Raw Data)，并粘貼到合適的軟件中，做到原始數據的導出。如果原始數據是導出到電子表格，因為軟件沒有自動輸出原始數據能力，必須手動輸入掃描中使用的激發和發射波長參數。掃描中的原始熱圖可以通過在Softmax Pro軟件中右鍵，選擇圖片另存為(Save Image As)的方式導出。
結果
在260nm波長激發，580nm波長發射組合下，氧化鐵納米顆粒具有最高的熒光值(10.1K相對信號強度，圖3，頂圖)。在mPEG包被下，氧化鐵納米顆粒的最高熒光值為5.1K，此時激發波長為270 nm，發射波長為570nm(圖3，底圖)。因此，相較于沒有包被的對照樣本，mPEG包被引起最佳激發和發射波長10 nm的遷移。由于光譜預掃描中采用的是10 nm步進，因此所觀察到的微弱遷移可能是來源于測量變異。但是近乎一半的熒光強度下降表明一些微弱的相互作用，即使到了結合解離平衡階段，也會引起顯著的熒光淬滅。相比下，氧化鋅納米顆粒在390 nm波長激發，670 nm波長發射下具有最強的熒光值13K，圖4，頂圖)。在mPEG包被下，氧化鋅納米顆粒最佳波長組合變為380 nm波長激發，695 nm波長發射，此時熒光值為95.6K(圖4，底圖)。因此，在5 nm 掃描步進下，mPEG包被能引起25 nm最佳發射波長的遷移，說明mPEG多聚物和氧化鋅納米顆粒表面存在相互作用。因為mPEG的結合會改變表面原子的電子性質。同時熒光信號的增強表明存在多聚物和材料中氧分子的相互作用。表3總結了上述的光譜掃描結果。
總結
測試中觀察到的20 nm 激發和發射波長位移表明氧化鋅納米顆粒和mPEG多聚物之間出現了靜電相互作用，相比下mPEG處理則不能引起氧化鐵納米顆粒的光譜特征改變。在此，我們展示如何通過結SoftMaxPro軟件的光譜優化向導，用SpectraMaxi3x多功能微孔板讀板機進行納米顆粒的表征和其表面相互作用的分析。該方法不僅可以用于質控納米分析表面功能化過程，還可以進一步在利用納米顆粒為載體運送靶向治療化合物的藥物開發過程中確保產品的正確包裝。