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  • 發布時間:2020-07-14 00:30 原文鏈接: 表面等離子共振技術在蛋白蛋白相互作用的應用(二)

    控制軟件
    SensiQ的控制軟件在原始反應曲線生成時,同時并實時獲取和展示兩個通道內的數據。參照通道內的數據被減除,以補償熱漂移、非特異性結合、總折射指數移相等效應,從而得到清晰高質的實驗數據。控制軟件在反應曲線上簡單加入報告點,用來確定樣品注入后產生的結合反應。報告點的添加可在實驗中的任何時候由人工進行,或由程序預設在固定的實驗周期之中。列于表格中的所有報告點,連同相關的事件紀錄,均有案可查。數據文件被儲存后可被控制軟件重新打開并編輯。


    SensiQ控制軟件的簡單明了的用戶界面,使得實驗設計和進行高效省時。實驗向導功能簡化設置過程,提高實驗重復性。

    QDATTM分析軟件
    反應曲線的分析以及其后的動力學和親和性數據測算通常繁瑣費時。SensiQ的QDATTM分析軟件極大地簡化了數據分析過程,為研究人員的動力學和親和性測定提供了簡單、省時、可信的手段。

    QDATTM是在Biologic Software公司應用廣泛的Clamp and Scrubber架構之上開發的最新一代分析軟件,可在幾分鐘內成功分析采集到的高質量數據。QDATTM的簡明友好界面帶領用戶通過一系列步驟,幾秒鐘內便完成信息的測算。QDATTM的模型擬合運用數字整合及優化的曲線擬合算法,迅速地估算最佳擬合參數值,確保相互作用模型和數據集的擬合,以測定動力學和親和性常數,以及濃度分析。QDATTM同時提供了簡單殘差圖和殘差標準差,用來定量評估擬合的程度。QDATTM的動力學擬合模型包括準一級結合模型(Pseudo-first-order Binding Model)和準一級傳質結合模型(Pseudo-first-order Binding Model with Mass Transport)。


    技術參數
    一次性生物傳感器是
    流動池數量2
    流動池選擇1,或2,或1和2
    流動池面積2.2 mm2
    流動池容積85 nL(高傳質率)
    樣品加入手動(注射器)
    樣品注入自動電腦控制人工電腦控制
    樣品雙通道同時注入是
    樣品注入體積10–250 μL
    樣品注射泵內置式外接式
    樣品流動速率5–150 μL /分自定(< 250 μL /分)
    內部死體積< 1.5 μL
    實時參照曲線減除是
    折射指數范圍1.32–1.401.33–1.40
    短期背景噪音< 0.25 RU< 1 RU
    長期背景噪音< 0.30 RU/分(當環境變化 < 3°C /小時)
    溫度控制15–40°C室溫
    尺寸(W x H x D)35.0 x 34.2 x 38.8 cm22.9 x 15.2 x 27.9 cm
    重量15.9 kg3.6 kg
    電源100–240 V,50/60 Hz
    工作范圍
    分子量低限< 200 Da< 250 Da
    ka(結合速率常數) 1 x 107 M–1s–1
    kd(解離速率常數)10–6–10–1 s–1
    KD(kd / ka)10–4–10–10 M
    濃度< 10–10–10–3 M

    傳感器表面化學

    胺基偶聯固定(COOH1和COOH2芯片)

    由于胺基基團的普遍性,所以通過胺基偶聯固定配體適用于絕大部分的生物分子。到目前我們發現這種方法將配體隨機固定,通常得到高質量的結果。因此通過沒必要直接固定特定位點。
          最常用的方法是使用NHS和EDC含水混合物活化羧基產生胺基活性脂。這個流程有以下的幾個好處:
    n        無需衍生作用,無需標簽,可以固定絕大多數生物分子
    n        產生大量穩定的共價鍵,以防止配體從表面濾掉
    n        在廣泛的pH值中是非常有效的
    n        生物分子無需暴露在惡劣的條件中
    n        很容易控制固定條件,可以防止與表面過度交叉連鎖
    n        化學試劑制備,凍存數月



    親和力捕獲表面組氨酸標簽蛋白(HisCap和HisHiCap芯片) 

    ICx Nomadics公司的HisCap芯片使聚組氨酸標簽蛋白的固定穩定、可逆,也讓表面等離子共振(SPR)實驗更加簡單。連有固定蛋白的基線非常穩定,可以做動力學分析實驗。
           HisCap芯片:
    n        提供一個直接固定His-tagged蛋白的最便利的手段。
    n        也可以適用于任何帶有足夠數量的組氨酸殘基的蛋白。
    HisCap芯片采用Hoffman-LaRoche研發建立的NTA-Ni技術來附著蛋白質。在這種技術中,感興趣蛋白質的組氨酸的側鏈咪唑與表面附著的NTA-Ni復合物共協作,如圖所示。只要蛋白質有足夠的組氨酸,這種技術就非常有效。典型的組氨酸標簽是6個組氨酸,但是3個也可以。
    HisCap芯片優勢:
    n        在實驗室的重組蛋白工作中,His-tagging是一個長期建立的標準技術。
    n        利用HisCap芯片捕獲His-tagged蛋白產生穩定的基線。
    n        在溫和的條件,可以再生芯片。例如EDTA或者咪唑。
    n        可重復使用HisCap芯片。


    囊泡捕獲膜受體相互作用(VesCap芯片)

    利用ICX囊泡捕獲(VesCap)芯片可以研究分子與細胞膜、脂質體的相互作用,進行實時、無標記的實驗。在VesCap芯片中,脂雙層好像在自然細胞環境中,自身構造中的各種細胞膜組分可以在細胞膜真實模型中自由混合。我們還不能確認囊泡溶入單膜雙層,但是這在二維表面是極其可能。
    n        一個好的實驗模型應包含藥物、毒素以及在細胞信號中所涉及的周邊膜關聯蛋白質
    n        膜蛋白和伴生蛋白只在真實的細胞膜中相互作用
    n        可以固定著床在脂質體的受體/配體
    VesCap芯片性質:
    n        脂雙層和膜蛋白的自身結構依保持不變。在傳感器表面的囊泡捕獲是非共價的,允許任意方向上的膜組分自由融合。
    n        PEG-正葵胺層展示出一個簡單的二維相互作用平面。
    n        附著在表面的囊泡、脂類體的制備很簡單。
    n        VesCap化學特別適合一個過度表達表面受體的細胞系
    n        VesCap芯片的再生很簡單。表面活化劑和溶劑的組合清除VesCap芯片表面所有的囊泡,從而再生VesCap芯片。


    親和素-生物素固定(BioCap和AvCap芯片)

    通過親和素-生物素為基礎的方法固定生物分子,操作簡單、效果出色,在今天仍然廣受研究人員的歡迎。利用了這個技術,BioCap芯片和AvCap芯片可靠固定配體。示意圖如下描繪了這兩種固定方法。主要優勢在于: 
    n      不依賴于蛋白質的等電點
    n      只需要少量配體
    n      可商業獲取,廣泛的生物素試劑
    n        生物素試劑盒操作簡單
    n        固定只需要簡單的注射
    n      當所需的Rmax達到時,停止注射可以精確的控制固定結合物的濃度
    n      相對于COOH芯片,表面具有很低的靜電電荷
    n      一個生物素反應通常產生足夠產物,可以無限量的固定。

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