要做PCR的血液標本如何保存

最好是用淋巴細胞分離液把單個核細胞分離出來，然后-80℃保存。

外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的分離是免疫學研究中的一項基本技術。目前國內外分離PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation），用此方法分離PBMC純度可達95％，淋巴細胞約占90％，其中T淋巴細胞占80％，B淋巴細胞占4～10％。ficoll-hypaque混合溶液，又稱淋巴細胞分層液，在分離人PBMC時，要求其比重為1.077；分離小鼠單個核細胞時比重為1.080；分離大鼠單個核細胞時比重為1.084～1.087；分離馬單個核細胞時比重為1.090。

【原理】  

血液中各有形成分的比重存在差異，利用比重為1.077、近于等滲的ficoll-hypaque混合溶液（又稱淋巴細胞分層液）作密度梯度離心時，各種血液成分將按密度梯度重新聚集。血漿和血小板由于密度較低，故懸浮于分層液的上部；紅細胞與粒細胞由于密度較大，故沉于分層液的底部；PBMC密度稍低于分層液，故位于分層液界面上，這樣就可獲得PBMC。

    【器材與試劑】

    1.刻度離心管、吸管、試管、毛細吸管、橡皮乳頭、載玻片、蓋玻片、離心機等。

    2.pH7.2 Hanks液、肝素、生理鹽水溶液，淋巴細胞分層液。

    【方法】

1.靜脈取血2ml，加入含肝素溶液(10～50u／m1血樣本)的試管中，混勻，使血液抗

凝。用pH7.2 Hanks液將抗凝血稀釋1倍。

2.吸取2ml淋巴細胞分層液置于刻度離心管中，然后將離心管傾斜45O角，用毛細滴管將稀釋的全血沿管壁緩慢加至分離液上面，應注意保持兩者界面清晰。

3.在18℃～20℃下，用水平離心機以2000r/min離心20min。離心后細胞分布如圖。

 4.用毛細吸管輕輕插到混濁帶，沿管壁輕輕吸出此層細胞，移入另一支離心管中。即要吸取所有單個核細胞，又要避免吸取過多的分層液或血漿，以免混入其他細胞成分。

5.用Hanks液洗滌細胞3次。第一次2000r/min ，10 min；第2～3 次1500r/min ，10 min，可去掉大部分混雜的血小板。

6.將沉淀細胞懸于培養基中備用。

        【注意事項】

    1、實驗所用玻璃器皿應該潔凈。如果制備的單個核細胞懸液用于細胞培養時，上述操作過程都要在無菌條件下進行，所用器材、試劑都應為無菌。

    2、實驗中的細胞得率與室溫及分層液比重等有關。分層液應避光4℃保存。

3、往淋巴細胞分層液中加入稀釋全血時，不得將血液沖入分離液中，須保持兩層液體的清晰界面。