詳細舉例介紹PCR引物設計的流程

 先幾個比較好用的PCR引物數據庫

    Primerbank（HS and MM)

    http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

    OriGene

    https://www.origene.com/category/gene-expression/qpcr-primer-pairs

    qPrimerDB

    https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/

    RTPrimerDB

    http://www.rtprimerdb.org

    NCBI Probe

    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe
    

    引物設計流程

    1. 獲取序列

    登陸NCBI, Gramene, EBI等核酸數據庫，收索相關序列并根據需求下載目標格式文件。
    

    2. 序列編輯與整理

    可以通過DNAman, DNA star ,Geneious等軟件將下載好的序列進行編輯整理。
    

    3. 引物定位

    推薦軟件：Blastn/p，ClustalW。
    

    4.引物設計

    推薦軟件：Primer Premier,還可以利用高級引物功能，進行引物數據庫收索，巢式引物設計，引物編輯分析等其他功能。
    

    5.獲取序列

    結合設計出的引物和序列編輯整理軟件獲取擴增后目標序列，并進行比對分析；并指導引物定位和序列編輯整理。
    

    6.引物綜合評價

    推薦軟件Primer Blast，Oligo等。

    評價指標：Tm值，GC含量，長度，二級結構，結合位點特異性,可以通過軟件對這些指標進行評定，特別是實時定量PCR原理實驗，引物的擴增效率對檢測準確性的影響非常大。
    

    定量PCR引物的驗證和具體評價方法

    設計原則

    產物長度在80-300bp之間

    產物GC含量在50-60%之間

    引物的GC含量在50-60%之間，熔解溫度在55-65℃之間

    應避免引物中有連續的G或C，但推薦在引物的末端含有G或C

    應避免出現二級結構

    驗證方案

    標準曲線法。

    制作標準曲線,選擇合適的標準品作為擴增模板，梯度稀釋，擴增結束后以模板系列稀釋倍數log值為X軸，以對應的Ct值為Y軸（反之亦可），制作標準曲線。

    擴增效率（E）計算公式：E=10-1/斜率-1

    即一般認為擴增效率應介于90——110%之間，與之相對應的斜率介于-3.58——-3.1之間。

    在其它參數正常的前提下，即可判定定量PCR引物擴增效率良好。

    通過數據庫或者軟件獲得的引物序列，對引物的各種指標進行評定，可以對引物的擴增效率有一個前瞻性的認識，特別是定量PCR實驗，引物的擴增效率對檢測準確性的影響非常之大。