實驗材料 表達 GST 融合蛋白的大腸桿菌細胞
試劑、試劑盒 二硫蘇糖醇谷胱甘肽洗脫緩沖液磷酸緩沖鈉鹽溶液TritonX-100DNase溶菌酶RNase凝血酶、腸激酶或 Xa 因子溶液SDS-聚丙烯酰胺凝膠
儀器、耗材 SorvallSS-34 轉頭或相當的轉頭谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂皮下注射針頭
實驗步驟
材料
緩沖液和溶液
貯存液、緩沖液和試劑的成分參見附錄 1。
貯存液稀釋至適當濃度。
二硫蘇糖醇（1mol/L)
谷胱甘肽洗脫緩沖液
10mmol/L 還原型谷胱甘肽
50 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
磷酸緩沖鈉鹽溶液（PBS)(4°C)
TritonX-100(0.2%V/V)
酶和緩沖液
DNase(5 mg/ml)
溶菌酶
RNase(5 mg/ml)
凝血酶、腸激酶或 Xa 因子溶液
溶液的配制和貯存參照生產商手冊。
凝膠
SDS-聚丙烯酰胺凝膠（10%)
用于分離蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠的制備請參考附錄 8。
離心機和轉頭
SorvallSS-34 轉頭或相當的轉頭
特別配備
谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂
必要時用 20% 乙醇將樹脂調成 50% 勻漿。
皮下注射針頭（18#22#和 25#)
載體和細菌菌株
表達 GST 融合蛋白的大腸桿菌細胞（方案 1 或 2 的步驟 17 所制備的細胞沉淀）。
方法
谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的處理
1. 輕輕顛倒盛有谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的容器，將樹脂混成勻漿。
2. 取部分勻漿放入 15 ml 聚丙烯管（每 100 ml 細菌培養物需要 2 ml 勻漿)。
3.4°C500 g(2100r/min Sorvall SS-34 轉頭）離心 5 min, 小心去掉上清。
4. 在樹脂中加入 10 倍柱床體積的冷的 PBS, 顛倒數次，混合均勻，4°C 500 g(2100r/min SorvallSS-34 轉頭）離心 5 min, 小心去掉上清。
5. 每毫升樹脂加入 lml 冷的 PBS, 制成 50% 勻漿，顛倒數次，混合均勻，懸液冰上放置待用。
制備細胞抽提物
6. 每 100 ml 培養物的細胞沉淀（方案 1 步驟 17) 懸于 4 mlPBS。
7. 加入溶菌酶至終濃度 1 mg/ml, 冰上放置 30 min。
有些方案中在親和純化 GST 融合蛋白之前，采用超聲或弗氏壓碎的方法裂解細胞。使用溶菌酶的方法重復性更好，而且不會引起細胞的災難性裂解. 后者釋放外膜蛋白和能引起 GST 融合蛋白聚集或者能與其共純化的其他分子。
8. 用針筒將 10 ml 0.2% TritonX-100 強行注入黏的細胞裂解物中，劇烈振動數次混勻。
加入 DNase 和 RNase 至終濃度 5ug/ml,4°C 振動溫育 10 min。3000 g(5000r/min Sorvall SS-34 轉頭）離心 30 min, 去除不溶性細胞碎片。上清（細胞裂解物）轉移到一只新管中，加入 DTT 至終濃度 lmmol/L。
為防止純化過程中樹脂被堵寒，上清液需要用 0.45um 濾膜過濾。
加人 TritonX-100 的目的是防止蛋白聚集。能溶解融合蛋白又不干擾谷胱甘肽-瓊脂糖親和純化的變性劑有 1%(V/V）TritonX-lOO, 含 10 mmol/L DTT 的 1%(WV)Tween-20,0.03%(m/V)SDS 和 1.5%(m/V) 十二燒基肌氨酸（Smith and Johnson1988;Frankel et al.1991;Grieco et al,1992)。加入 Tween-20、SDS 和 N-十二烷基肌氨酸可以替代 TritonX-100 或與其共同作用。請參考疑難解析：不溶性蛋白。
純化融合蛋白
9. 細胞裂解物與適量 50% 谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混和，每 100 ml 細菌培養物加 2 ml 樹脂，于室溫輕搖 30 min。
10. 混合物于 4°C 以 500 g(2100r/min SorvallSS-34 轉頭）離心 5 min, 小心去掉上清并留樣少許進行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳。
11. 沉淀中加入 10 倍柱床體積的 PBS, 顛倒離心管數次混勻，洗去未與樹脂結合的蛋白。
12.4°C 以 500 g（2100r/min SorvallSS-34 轉頭）離心 5 min, 小心去掉上清并留樣少許進行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳。
13. 重復步驟 11 和 12 兩次
14. 結合的 GST 融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫，也可用凝血酶、腸激酶或 Xa 因子切割，釋放靶蛋白。
用谷胱甘肽洗脫融合蛋白
a. 沉淀中加入 1 倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液，室溫輕輕攬動 10 min, 洗脫樹脂上結合的蛋白。
b. 如步驟 12 離心，上清（含洗脫的融合蛋白）移至新管中。
c. 重復步驟 a 和 b 兩次，合并 3 次的上清。
經過上述洗脫步驟后，有些蛋白可能還會有大量的仍結合在樹脂上，有時可能需要進一歩洗脫. 而且蛋白不同洗脫體積和時間也應有所區別。SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳可以監測洗脫液中 GST 融合蛋白含量。對于 GST 融合蛋白，一般情況是 1A280=0.5 mg/ml, 測定 280mn 吸收可以估算融合蛋白的產量，也可以采用標準的生色法（Lowry or Bradford) 測定融合蛋白的產量，如果采用 Lowry 法，樣品必須先用 2000 倍體積的 1XPBS 透析，去除谷胱甘肽，否則的話會干擾測定，而 Bradford 法不受谷胱甘肽的影響。
蛋白酶解從結合的 GST 融合蛋白上回收靶蛋白
a. 在結合了融合蛋白的樹脂中加入凝血酶、腸激酶或 Xa 因子（根據融合蛋白中的位點選擇)。每毫升樹脂加入 50 單位溶于 lmlPBS 的蛋白酶。顛倒離心管數次混勻，室溫下振蕩 2~16 h。用小規模試驗確定精確時間。
b.4°C 以 500 g（2100r/min Sorvall SS-34 轉頭）離心 5 min, 上清小心轉移到新管中。
GST 仍結合在樹脂上，而靶蛋白在上清中，蛋白酶也在上清中。用傳統的層析方法或 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離白和蛋白酶。
15.10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析每一步（細胞抽提、洗滌和洗脫）樣品的蛋白質組成。
