質粒與載體

一、質粒

絕大多數的生物都是以DNA 的形式來儲藏其遺傳信息。遺傳物質要能生生不息地傳給后代的首要條件就是它至少要具有一個復制原(ori, origin of replication，或譯為復制起點)，使整個基因體得以復制。含有復制原的遺傳物質稱為replicon，我們姑且把它譯為為復制體吧！原核性復制體分為原核染色體、質粒(plasmids)和噬菌體基因體(phage genome)等三類。

其中質粒的基因體和原核染色體類似，是由雙絞煉DNA 構成，并以超卷曲的形式存在。它們的基因體約由2,000至150,000個堿基對組成，絕大多數呈環狀，但也有極少數是線狀構造(如Borrelia burgdorfferi)。事實上你可以把它們視為比較小的原核染色體。在自然環境中它們相當普遍地生存在原核生物細胞內，并和其宿主的許多特殊功能有關，諸如：赤賀氏桿菌(Shigella)的抗藥、根瘤菌(Rhizobium)的固氮、農桿菌(Agrobacterium)的引瘤及假單胞桿菌(Pseudomonas)對環狀有機物的分解等等。以下我們談的以細菌性質粒為主，尤其是革蘭氏陰性菌的質粒。

二、質粒的類型

當我們談到質粒的類型時，就要看你從哪個角度來看它們，譬如說抗藥性、結合生殖能力、宿主范圍及DNA 復制方式等等。這些分型標準之間并無橫向關聯。你無法說能結合生殖的質粒一定抗藥或不抗藥，也無法確定宿主范圍和質粒套數的調控有何關聯。我們用到這些名詞時，只是對特定質粒的性狀做一些描述而已。質粒的真正系統分類標準并非靠些性狀，而是依據它們的不共容性(incompatibility)。

有的質粒帶有顯著特征可供我們偵測它們的存在，無已知特征的質粒稱為隱性質粒(cryptic plasmids)；有特征者稱為顯性質粒(acryptic plasmids)；帶有抗藥基因的天然質粒稱為R-質粒(R-plasmids)。有些質粒能在多種不同菌屬細胞中生存，我們稱它們為泛宿主性質粒(broad-host-range plasmids)；有一些質粒只能在少數相關宿主中生存，我們稱它們為狹宿主性質粒(narrow-host-range plasmids)。具有結合生殖(conjugation)能力的質粒為結合質粒(conjugative plasmids)；沒有這種能力的質粒便是非結合質粒(non-conjugative plasmids)。其它如侵襲性質粒(virulence plasmid)、共生質粒(symbiotic plasmids)及巨型質粒(megaplasmids)等等有關質粒性狀敘述的名詞不一而足。

三、質粒的復制

環狀質粒的復制形式主要分theta (θ)及rolling circle兩種。基因體的復制都是由復制原開始。原核性復制原約由250個堿基對組成，一般質粒的復制原常稱為oriV (origin of vegetative replication)；有時R-質粒的復制原稱為oriR；大腸桿菌的復制原稱為oriC。Theta形式的質粒復制與細菌基因體復制一樣，以RNA 聚合?(RNA polymerase)在復制原制造RNA 引子(RNA primer)，然后由DNA 聚合?(DNA polymerase)接手由此向兩個方向分別復制DNA ，直到整個基因體復制完成。在復制過程中當然還有許多其它酵素的參與，這些酵素多由宿主提供。

有的質粒自己攜帶一些與復制有關的基因，這些基因多被命名為rep，如repA、repB等等。Rolling circle形式的質粒復制與部分噬菌體基因體的復制相似。環狀雙絞鏈中的一股在復制原附近被酵素切開，然后環狀股與線狀股被分別復制完成。至于線狀質粒的復制則是靠特殊的RNA 引子或該質粒所具有的telomere-like sequence。

四、質粒的套數與套數調控(copy number control)

在一個宿主細胞中某一特定質粒出現的個數稱為套數(copy number)。在大腸桿菌中，質粒的套數由F-質粒(fertility plasmid)的一個到pUCs的數百個不等。質粒套數的控制與該質粒復制的調控機制有關，幾乎每一種質粒都有它獨特之處。有關質粒套數的控制我們僅以兩種代表型機制來說明。

1. 反意RNA (antisense RNA )：

ColE1質粒的復制是由RNA 聚合?由其復制原(oriV)前方 555個堿基對以前的啟動子(promoter)讀出一段稱為RNA II的產物。這個稱為前引子(preprimer)的RNA II會利用堿基配對而自我折迭成可被RNA ase H(一種特殊的RNA 水解?)裁剪的立體結構。RNA II經適當的裁剪后就形成正確的復制引子，復制于焉開始。在ColE1質粒復制原前方445個堿基對的后方另有一個反向的啟動子。

RNA 聚合?由此處轉錄出一條稱為RNA I的產物，它與RNA II反向，剛好形成配對，這種RNA 稱為反意RNA (antisense RNA )。當RNA I和RNA II形成RNA -RNA 雜合體(RNA -RNA hybrid)時，RNA II無法形成可被RNA ase H剪裁的結構，復制引子無法產生，復制也不會有效地開始。當然，實際上還有許多輔助蛋白和酵素會控制RNA I和RNA II之間的親合力和RNA I的水解速度。RNA I和RNA II的相對數量的增減決定了ColE1質粒的復制速度，也決定了該質粒的套數。

2. Iterons與repA：

質粒pSC101的復制除了需要宿主供應的酵素外尚需要RepA蛋白。RepA是pSC101的基因產物，在功能上他扮演了復制的活化因子(activator)與自我抑制因子(autorepressor)。RepA基因位于pSC101復制原的前方，其轉錄方向和pSC101復制方向正好相反。在RepA基因的啟動子和pSC101復制原中有好幾個順向和反向的重復DNA 短段，長約18~22個堿基對，稱為iteron(s)。RepA會粘黏在iteron上。質粒在低濃度(低套數)時，產生低濃度的RepA促進了質粒的復制；質粒在高濃度(高套數)時，產生大量的RepA粘黏在復制原和RepA基因的啟動子上抑制質粒的復制。于是，RepA和iterons的相互作用決定了pSC101的套數。

五、質粒的不共容性(incompatibility)

有時我們會想知道一個細菌細胞中會同時出現多少種質粒呢(種類非個數，個數是指套數)？這個問題倒沒有一個確切的答案。

由自然環境分離的細菌細胞中含有一至三種質粒是常見的，有時多至七、八種也不令人意外。質粒的種類雖多，但并非所有的質粒都能同時在同一個宿主細胞中生存。有一些質粒在同一個宿主細胞中會發生相互排斥的現象，我們稱這種現象為質粒的不共容性(incompatibility)。

質粒的不共容與他們的復制機制與套數調控有關。當兩種復制與套數調控機制毫不相干的質粒在同一個細胞中生存時，它們各自復制再各自分配到不同的子細胞中，不會發生干擾。

當兩種復制機制與套數調控相關或甚至相同的質粒在同一個細胞中生存時，復制與套數調控機制就會把它們看做同一種質粒而將他們的套數控制在一定的數目內。因為細胞分裂時質粒在子細胞中分配不均勻的緣故，經過幾十次的細胞分裂后你只可能在特定的子細胞中找到其中一種質粒。

根據這種不共容性，質粒被分為許多不共容群(incompatibility group，簡稱為inc)，譬如RP4屬于incP；RSF1010屬于incQ而pSa屬于incW等。如果你在實驗中發現有一種質粒竟然屬于兩個不同的不共容群或有不共容不完全的現象。別驚慌！那是有可能發生的。在革蘭氏陰性菌中，大腸桿菌與假單胞桿菌的質粒分類是做的比較清楚的。