質粒提取（三）

10)按步驟8)所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因為有時沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發殆盡，管內無可見的液體(2-5)分鐘。

11)用50μl含無DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。

注:當從表達內切核酸酶A的大腸桿菌株(endA⁺株，如HB101 )中小量制粒尤其DNA時，建議舍棄煮沸法。因為煮沸步驟不能完全滅活內切核酸酶A，以后在Mg²⁺存在下溫育(V中用限制酶時)質粒DNA可被降解。在上述方案的步驟9)之間增加一步，即用酚:氯仿進行抽提，可以避免這一問題。

(二)質粒DNA小量制備的問題與對策

裂解和煮佛法都極其可靠，重復性也很好，而且一般沒有會么麻煩。多年來，在我們實驗室中日常使用這兩種方法的過程中，只碰到過兩個問題:

1)有些工作者首次進行小量制備時，有時會發現質粒DNA不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時注意得不夠。大多數情況下，用酚:氯仿對溶液進行抽提可以去除小量備物中的雜質。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化DNA。

2)在十分偶然的情況下，個別小時制備物會出現無質粒DNA的現象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。

三、質粒DNA的大量制備

在豐富培養基中擴增質粒

細菌的收獲和裂解

收獲

堿裂解法

(一)在豐富培養基中擴增質粒

許多年來，一直認為在氯霉素存在下擴增質粒只對生長在基本培養基上的細菌有效，然而在帶有pMBl或ColEl復制子的高拷貝數質粒的大腸桿菌菌株中，采用以下步驟可提高產量至每500ml培養物2-5mg質粒DNA，而且重復性也很好。

1)將30ml含有目的質粒的細菌培養物培養到對數晚期(DNA 600約0.6)。培養基中應含有相應抗生素，用單菌落或從單菌落中生長起來的小量液體閉關物進行接種。

2)將含相應抗生素的500ml LB或Terrific肉湯培養基(預加溫至37℃)施放入25ml對數晚期的培養物，于37℃劇烈振搖培養25小時(搖床轉速300轉/分)，所得培養物的OD₆₀₀值約為0.4。

3)可做可不做:加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇)，使終濃度為170μg/ml。像pBR322一類在宿主菌內只以中等拷貝婁竿行復的質粒，有必要通過擴增。這些質粒只要從生長達到餉新一代的質粒(如pUC質粒)可復制達到很高的拷貝數，因此無需擴增。這些質粒只要從生長達到飽和的細菌培養物即可大量提純。但用氯霉素進行處理，具有抑制細菌復制的優點，可減少細菌裂解物的體積和粘稠度，極大地簡化質粒純化的過程。所以一般說來，盡管要在生長中的細菌培養物里加入氯霉素略顯不便，但用氯霉素處理還是利大于弊。

4)于37℃劇烈振搖(300轉/分)，繼續培養12-16小時。

(二)細菌的收獲和裂解

1.收獲

1)用合適轉頭于4℃以4000轉/分離心15分鐘，棄上清，敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。

2)將細菌沉淀重懸于100ml用冰預冷的STE中。

STE

0.1mol/L NaCl

10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)

1mmol/L EDTA(pH8.0)

2)按步驟1)所述方法離心，以收集細菌細胞。

2，堿裂解法

1)將冼過的500ml 培養物的細菌沉淀物[ 來自收獲細菌的步驟3] 重懸于10ml(18ml)溶液I中。

溶液I

50mmol/L葡萄糖

25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)

10mmol/L EDTA(pH8.0)

溶液I可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x10⁴Pa)高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。

2)加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。當溶液的pH值低于8.0時，溶菌酶不能有效工作。

3)加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。

溶液Ⅱ

0.2mol/L NaOH(臨用前用10mol/L貯存液現用現稀釋)

1%SDS

蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數次，以充分混勻內容物。于室溫放置5-10分鐘。

4)加15nl(20ml)用冰預冷的溶液Ⅲ。

溶液Ⅲ

5mol/L乙酸鉀 60ml

冰乙酸 11.5ml

水 28.5ml

所配成的溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L。

封住瓶口，搖動離心瓶數次以混勻內容物，此時應不再出現分明的兩個液相。置冰上放10分鐘，應形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應包括染體DNA、高分子量RNA和鉀-SDS^-蛋白質-膜復合物。

5)用合適轉頭于4℃以4000轉/分離心15分鐘，不開剎車而使轉頭自然停轉。如果細菌碎片貼壁不緊，可以5000轉/分再度離心20分鐘，然后盡可能將上清全部轉到另一瓶中，棄去殘留在離心管內的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液Ⅲ與細菌裂解物混合不充分[步驟4)]。

6)上清過濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。

7)用合適轉頭于室溫以500轉/分離心15分鐘，回收核酸。如于4℃離心，鹽也會了生沉淀。

8)小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70%乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮殆盡。

9)用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。

10)純化。