質粒提取（二）

2)加200μl新配制的溶液Ⅱ。

溶液Ⅱ

0.2mol/L NaOH(臨用前用10mol/L貯存液現用現稀釋)

1%SDS

蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內容物。應確保離心管的整個內表面

均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。

3)加150μl用冰預冷的溶液Ⅲ

溶液Ⅲ

5mol/L乙酸鉀 60ml

冰乙酸 11.5ml

水 28.5ml

所配成的溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L。

蓋緊管口，將管倒置后和地振蕩10秒鐘溶液Ⅲ在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后

將管置于冰上3-5分鐘。

4)用微量離心機于4℃12 000g離心5分種，將上清轉移到另一離心管中。

5)可做可不做:加等量酚:氯念，振蕩混勻，用微量離心機于4 ℃以12000g離心2分鐘，將上清轉移到另一良心管中。有些工作者認為不必用酚:氯仿進行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會得到可耐受限制酶切反應的DNA。

6)用2倍休積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合，于室溫放置2分鐘。

7)用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘。

8)小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡量使吸頭遠離核酸沉淀，然后繼續用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。

9)用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟8)所術方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。

i.此法制備的高拷貝數質粒(如Xf3或pUC)，其產量一般約為:每毫升原細菌培養物3-5μg。

ii.如果要通過限制酶切割反應來分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量離心管內，加1μl 10×限制酶緩沖液和1單位所需限制酶，在適宜溫育1-2小時。將剩余的DNA貯存于-20℃。

iii.此方法按適當比例放大可適用于100ml細菌培養物:

3.煮沸裂解

1)將細菌沉淀，所得重懸于350μlSTET中。

STET

0.1mol/L NaCL

10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)

1mmol/L EDTA(pH8.0)

5% Triton X^-100

2)加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發揮作用。

3)將離心管放入煮沸的水浴中，時間恰為40秒。

4)用微量離心機于室溫以12 000g離心10分種。

5)用無菌牙簽從微量離心管中去除細菌碎片。

6)在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉(pH5.2)和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。

7)用微量離心機于4℃以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。

8)小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離核酸沉淀，然后繼續用吸頭通過抽真空除去附于管的液滴。

9)加1ml 70%乙醇，于4℃以12 000g離心2分鐘。