質粒轉化大腸桿菌

該實驗主要有兩個用途：

1．重組質粒的鑒定。當質粒的重組或其它載體重組后，通常會發生質粒的重組失敗，包括質粒的自身環化。因而要求進行篩選，把重組成功的質粒找出來。在目前常用的質粒和其它載體中含有相應的抗生素抗性基因，一旦重組成功，質粒環化（包括自身環化），抗生素抗性基因表達，被轉化的大腸桿菌便具備抗相應抗生素的能力，可以含該抗生素的培養基中生長傳代，不然，重組失敗，大腸桿菌便不能抵抗該抗生素而死亡。

2.為擴增質粒和其它載體作準備。由于大腸桿菌繁殖快，在適宜的條件下繁殖一代僅需要20~30分鐘，而且常用質粒可以在大腸桿菌中達到幾百個拷貝，因此，通過對轉化成功的大腸桿菌培養，可以在短時內極大地擴增目的質粒。（作為分子生物學用大腸桿菌，是經過實驗室改造過的工程菌。）

實驗原理

本實驗通過CaCl2對特定的大腸桿菌處理，制備感受態的細菌。這些細菌可使每微克超螺旋質粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重組質粒，產生5×106~2×107個轉化的菌落。當質粒與這些大腸桿菌混合后，質粒粘附在大腸桿菌的表面，在42℃的溫度時，大腸桿菌出現熱休克，質粒可通過大腸桿菌細胞膜上形成的空隙進入菌體內。隨后，加入LB培養液，于37℃振動培養可使細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性基因，提高轉化效率。轉化成功的大腸桿菌可以在相應抗生素培養皿中傳代，形成菌落。

實驗準備

一．器材

天平、秤量匙、秤量皿

加熱磁力攪拌器、攪拌子

可調移液器P1000、P200、P20及其經消毒的盒裝藍、黃吸頭

經消毒的1.5ml Eppendorf管、試管架及其水浴用試管架

定時器、記號筆、一次性手套和筒紙

42℃恒溫水浴

4℃和-70℃冰箱

煤氣燈或酒精燈

恒溫培養搖床（調至37℃，225rpm）

37℃培養箱

玻璃涂棒（普通玻璃吸管，細頭部在煤氣燈上燒成“L”形）

消毒過的潔凈培養皿（直徑10cm）

二．試劑

LB培養基

細菌培養用胰化蛋白胨10g

細菌培養用酵母提取物5g

NaCl 5g

加800ml水，放入磁力攪拌棒，在磁力攪拌器上攪拌至徹底溶解，用5M NaOH（約0.2 ml）調節pH值至7.0，加水定容至1000 ml。高壓15 lbf/in2（1.034×105pa）消毒30分鐘，冷卻后可加入氨芐青霉素（50mg/ml）500ul，視載體特性而定，混勻，即為含抗生素的LB培養液。存放于避光處。

含有瓊脂的培養基

即在以上1000ml培養基中加入15g細菌培養用瓊脂。

抗生素瓊脂平板

待含有瓊脂的培養基冷卻后，加入抗生素，傾入培養皿，約30~50 ml，用煤氣燈火焰掠過培養基表面，以消除氣泡。冷卻后，標記，封于塑料袋中，倒置，于4℃冰箱內避光保存。

pH試紙（或pH計）

三．實驗材料

來源于實驗一的重組質粒

受感態大腸桿菌

碎冰及碎冰保溫盛器

實驗步驟

自-70℃冰箱中取出受感態大腸桿菌，插入濕冰中溶解約15分鐘，輕輕混勻。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻將細菌放回-70℃冰箱。

細菌50 ul

DNA 5 ul

輕輕混勻，靜置冰上30分鐘。

于42℃水浴中熱休克細菌45秒，迅速移入濕冰中，靜置2分鐘，加入900ul LB培養液，放入37℃恒溫箱搖床，225rpm搖晃培養1小時。取50ul涂于含氨卞青霉素的LB瓊脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培養箱中過夜。

次日，檢查各培養皿中是否出現菌落。

實驗結果

轉化成功，培養皿中可見散在的菌落。

轉化失敗，培養皿上無菌落，或菌落布滿如苔樣，后者提示可能是抗生素濃度不夠或失效。