實驗概要
質粒（plasmid）是一種染色體外的穩定遺傳因子，大小從1~200kb不等，為雙鏈、閉環的DNA分子，并以超螺旋狀態存在于宿主細胞中。質粒主要發現于細菌、放線菌和真菌細胞中，它具有自主復制和轉錄能力，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數，并表達所攜帶的遺傳信息。質粒在細胞內的復制一般有兩種類型：緊密控制型和松弛控制型（高拷貝）。 從細菌分離質粒DNA的方法都包含3個基本步驟：培養細菌使質粒擴增；收集和裂解細胞；分離和純化質粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細胞壁，十二烷基磺酸納（SDS）可使細胞膜裂解。經溶菌酶和SDS處理后，細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上，同時由于細菌染色體DNA比質粒大得多，易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA變性，而共價閉合環狀DNA的兩條鏈不會分開，當外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA片段難以復性，而是與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起，而質粒DNA雙鏈又恢復原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態存在于液相中。
主要試劑
SDS 溶菌酶 酚 氯仿 無水乙醇 葡萄糖 EDTA 乙酸鉀 NaOH Tris堿 STET STE等
溶液I： 50mmol/L 葡萄糖溶液 25mmol/L Tris-Cl (pH8.0) 10mmol/L EDTA (pH8.0)
溶液II：0.2mol/L NaOH, 1%SDS
溶液III：5mol/L的乙酸鉀
實驗步驟
（一）細菌培養和收集
將含有質粒的Ecoli菌種接種在LB固體培養基（含50 μg/ml Amp）中，37oC培養12~24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養基（含50μg/ml Amp）中，37 oC振蕩培養約12小時至對數生長后期。
（二）質粒DNA的少量快速提取（堿法）
1． 取1.5ml培養液倒入1.5ml eppendorf管中，4 oC下12000g離心30s，棄上清，倒置片刻，使液體流盡。
2． 菌體沉淀重懸于100μl溶液Ⅰ中，劇烈振蕩使菌體充分重懸，加入新配制的溶液Ⅱ200μl，蓋緊管口，立即將離心管緩慢顛倒數次直到溶液變清亮，冰浴5min。
3． 加入150μl預冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，緩緩顛倒離心管數次直到白色沉淀充分形成，冰浴5min，離心5分鐘
4． 上清液移入干凈eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿（1 :1），震蕩混勻，4 oC下12000g離心5分鐘。
5． 將水相移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，震蕩混勻后置于-20 oC冰箱中20分鐘，然后4oC下12000g離心5分鐘。
6． 棄上清液，將管口敞開倒置于衛生紙上，使所有液體流出，加入1ml 70%乙醇液沉淀一次，4 oC下12000g離心5~10分鐘。
7． 吸除上清液，將管倒置于衛生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥。
8． 將沉淀溶于20μl TE緩沖液（pH8.0，含20μg/ml RNaseA）中，儲于-20oC冰箱中。
（三）純化：Wizard少量 DNA 純化系統
Promega公司的Wizard少量DNA純化系統可快速有效的抽提質粒DNA,整個過程只需15分鐘。提取的質粒可直接用于DNA測序、酶切分析和體外轉錄等。
該系統中所含試劑和柱子可以用于50次1-3ml質粒培養液的分離和純化，試劑包括10ml細胞懸浮液，10ml細胞裂解液；10ml中和液，50ml Wizard少量DNA純化樹脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml ）和50支Wizard微型柱。
1、1-3ml過夜培養細胞液4℃下 12000g離心1-2分鐘。
2、去除上清液，菌體細胞懸浮于200μl 細胞懸浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。
3、加200μl 細胞裂解液, 顛倒離心管數次,直到溶液變清亮。
4、加200μl 中和液,顛倒離心管數次。
5、4℃下12000g離心5分鐘，取上清液于新的eppendorf管中。
6、加1ml Wizard少量 DNA 純化樹脂,顛倒離心管數次以充分混勻。
7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進入微型柱。
8、將注射器與微型柱分開,取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2ml柱洗液,并用注塞輕推，使柱洗液進入微型柱。
9、取出微型柱置于eppendorf管中,離心2分鐘以除去微型柱中的柱洗液。
10、將微型柱放在一個新eppendorf管中，加50μl TE(或水)于微型柱中，靜止1分鐘后，4℃下12000g離心20秒。
11、丟棄微型柱，將eppendorf管中的質粒DNA貯于4℃或-20℃冰箱。
注意事項
1.提取過程盡量保持低溫。
2.采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好。
3.沉淀DNA通常用冰乙醇，低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉淀完全。
4.樹脂使用前應充分混勻,如有結晶,可將樹脂用25-37℃水浴處理10分鐘。
5.在使用之前,系統所提供的柱子洗脫液按1:1加入125ml 95％乙醇。
6.純化樹脂必須混勻后再用.