實驗概要
本方法用于從細菌中提純大量質粒DNA。
主要試劑
1. STE
0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
2. 溶液Ｉ
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)
溶液Ｉ可成批配制，在6.895x104Pa高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于４℃。
3. 溶菌酶溶液
10mg/ml，溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
4. 溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH(臨用前用10mol/L貯存液現用現稀釋)
1％SDS
5. 溶液Ⅲ
5mol/L乙酸鉀 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L。
實驗步驟
1. 收獲
1) 用合適轉頭于4℃以4000轉/分離心15分鐘，棄上清，敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。
2) 將細菌沉淀重懸于100ml用冰預冷的STE中。按步驟1)所述方法離心，以收集細菌細胞。
2. 堿裂解法
1) 將冼過的500ml 培養物的細菌沉淀物重懸于10ml溶液Ｉ中。
2) 加1ml新配制的溶菌酶溶液。當溶液的pH值低于8.0時，溶菌酶不能有效工作。
3) 加20ml新配制的溶液Ⅱ。蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數次，以充分混勻內容物。于室溫放置5-10分鐘。
4) 加15nl(20ml)用冰預冷的溶液Ⅲ。封住瓶口，搖動離心瓶數次以混勻內容物，此時應不再出現分明的兩個液相。置冰上放10分鐘，應形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應包括染色體DNA、高分子量RNA和鉀－SDS－蛋白質－膜復合物。
5)
用合適轉頭于4℃以4000轉/分離心15分鐘，不開剎車而使轉頭自然停轉。如果細菌碎片貼壁不緊，可以5000轉/分再度離心20分鐘，然后盡可能將上清全部轉到另一瓶中，棄去殘留在離心管內的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液Ⅲ與細菌裂解物混合不充分。
6) 上清過濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。
7) 用合適轉頭于室溫以500轉/分離心15分鐘，回收核酸。如于4℃離心，鹽也會了生沉淀。
8) 小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮殆盡。
9) 用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
10) 純化。
3. 質粒DNA的純化
1) 將所得核酸溶液轉入15mlCorex中，再加3ml 用冰預冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用合適轉頭于４℃下以10 000轉/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。
2) 將上清轉移到另一30mlCorex管內，加等量的異丙醇，充分混勻，用SorvallSS34轉頭（或與其相當的轉尖)于室溫以10 000轉/分離心10分鐘，回收沉淀的核酸。
3) 小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴斯德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管倒置，在紙巾上放置幾分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發殆盡。
4) 用500μl含無DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml )的TE（pH8.0)溶解沉淀，將溶液轉到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。
5) 加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000)的1.6mol/L NaCl，充分混合，用微量離心機于4℃以12000g離心5分鐘，以回收質粒DNA。
6) 吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解質粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。
7) 將水相轉到另一微量離心管中，加100μl 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加2倍體積（約1ml)乙醇，于室溫放置10分鐘，于4℃以12 000g離心5分鐘，以回收沉淀的質粒DNA。
8) 吸去上清，加200μl處于4℃以12 000g離心2分鐘。
9) 吸去上清，敞開管口，將管置于實驗桌上直到最后可見的痕量乙醇蒸發殆盡。
10) 用500μl TE（pH8.0)溶解沉淀1:100稀釋后測量OD260，計算質粒DNA的濃度（1OD260＝50μg質粒DNA/ml)，然后將DNA貯于－20℃。