質粒DNA提取實驗步驟

質粒DNA提取可以：(1)快速純化質粒;(2)用于測序、體外轉錄與翻譯、限制性內切酶消化、細菌轉化等分子生物學實驗。實驗方法原理質粒多為一些雙鏈、環狀的DNA分子，是獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。質粒是進行分子生物學實驗操作，進行遺傳工程改良物種等工作時最主要的DNA載體。

　　提取質粒的基本步驟分為三步：

　　①細菌的培養和質粒的擴增

　　②細菌菌體的裂解

　　③質粒DNA的純化

　　實驗材料 大腸桿菌

　　試劑、試劑盒 Tris-Hcl EDTA 葡萄糖 NaOH KAac NaAc 異丙醇 溶菌酶 酚:氯仿 無水乙醇 LB培養基

　　儀器、耗材 超凈工作臺 培養箱 搖床 恒溫水浴鍋 臺式離心機 取液器 低溫冰箱 冷凍真空干燥機電泳儀 水平電泳槽 紫外觀測儀

　　實驗步驟 一、材料與試劑準備

　　1. 材料：大腸桿菌。

　　2. 儀器：超凈工作臺，培養箱，搖床，恒溫水浴鍋，臺式離心機，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測儀。

　　3. 試劑：

　　(1)Solution I ：25 mM Tris-Hcl(pH7.4)，10 mM EDTA(pH8.0)，50 mM葡萄糖，高壓滅菌，4℃保存。

　　(2)Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 現配現用。

　　(3)Solution III ：5 N KAc pH4.8，高壓滅菌，4℃保存。

　　(4)3 M NaAc pH5.2，高壓滅菌，4℃保存。

　　(5)異丙醇，溶菌酶(8 mg/ml)，酚/氯仿，無水乙醇，70%乙醇，LB培養基，電泳試劑。

　　二、操作步驟

　　1. 細菌繁殖：LB培養基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，搖一搖，過夜。

　　2. 離心10 min，5 000 rpm， 4℃;棄上淸液。

　　3. 沉淀(菌體細胞)預冷的TES緩沖液洗滌，離心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入預冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。

　　4. 重新懸浮，加入150 ul溶菌酶母液，室溫放置5 min。

　　5. 加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。

　　6. 加入0.9 ml預冷乙酸鉀，混勻，離心10 min，12 000 rpm，4℃。

　　7. 加入1.5 ml異丙醇，-20℃冰箱內放置15 min。

　　8. 離心10 min，12 000 rpm，4℃。

　　9. 取沉淀，懸于400 ul TE緩沖液中。

　　10. 加入40 ul，3 M NaAc。

　　11. 酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。

　　12. 離心10 min，12 000 rpm，4℃。

　　13. 取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50 ul TE緩沖液中。

　　14. 電泳檢測提取DNA的質量。