實驗概要
通過本實驗學習瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術。
實驗原理
DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷在電場中向正極移動。由于糖－磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即DNA分子本身的大小和構型。具有不同的相對分子質量的DNA片段泳動速度不一樣，可進行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質量對數值成反比關系。凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質量的DNA， 也可以分離相對分子質量相同，但構型不同的DNA分子。如上次實驗提取的pUC19質粒，有3種構型：超螺旋的共價閉合環狀質粒DNA(covalently closed circular DNA，簡稱 CCCDNA)；開環質粒DNA，即共價閉合環狀質粒DNA 1條鏈斷裂，（open circular DNA， 簡稱OCDNA）；線狀質粒DNA ，即共價閉合環狀質粒DNA 2條鏈發生斷裂，（linear DNA，簡稱L DNA）。這3種構型的質粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA和開環質粒DNA。
主要試劑
1. 10 x TAE (10倍體積的TAE儲存液)
配 1000mL50 x TAE：
Tris 242g
冰乙酸 57.1ml
0.5 mol/L EDTA 100 ml
pH 8.0
2. 凝膠加樣緩沖液（6x）
溴酚藍 0.25％
蔗糖 40％
3. 瓊脂糖（1%）：稱1g瓊脂糖，放入250 mL三角瓶內，加入100 mL 1×TAE電泳緩沖液，加熱煮沸等其冷至60℃左右，倒入封好的電泳板上。
4. 溴化乙錠溶液 (EB) 0.5 μg /mL。
主要設備
電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、移液槍一套、微波爐。
實驗步驟
（一）制備瓊脂糖凝膠
按照被分離DNA的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。可參照下表：
瓊脂糖凝膠濃度／％ 線狀DNA的有效分離范圍／Kb
0.3 5 ～60
0.6 1 ～20
0.7 0.8～10
0.9 0.5～7
1.2 0.4 ～6
1.5 0.2～4
2.0 0.1～3
稱取0.1g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入10mL 1XTAE緩沖液，至微波爐加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1％的瓊脂糖凝膠液。
（二）膠板的制備
1. 取有機玻璃內槽，洗凈，晾干，用橡皮膏將有機玻璃內槽的兩端邊緣封好。
2. 將有機玻璃內槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。
3. 將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機玻璃內槽，直至有機玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。
4. 待膠凝固后，取出梳子，放在電泳槽內。
5. 加入電泳緩沖液至電泳槽中。
（三）加樣
將樣品5uL與上樣緩沖液1uL混合，用移液槍將該混合樣品加入樣品孔（記錄點樣順序及點樣量）。同時加入DNA marker和購買的pUC18質粒
作為對照。
（四）電泳
1. 接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負極，DNA片段從負極向正極移動）。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5 V/cm。
2. 當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿1～50px處，停止電泳。
（五）染色
將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液（0.5mg/mL）中，染色以觀察在瓊脂糖凝膠中的帶（戴手套操作）。
（六）觀察
注意事項
1．EB是強誘變劑并有中等毒性,配制和使用時都應戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經專門處理后才能清 洗或丟棄。
2．當EB太多，膠染色過深,DNA帶看不清時，可將膠放入蒸餾水沖泡，30分鐘后再觀察。
3．電泳時注意導線正負極，防止接反。