質粒DNA電泳鑒定

1．目的

學會常用的DNA瓊脂糖凝膠電泳。

2．原理

DNA雙螺旋分子骨架兩側帶有含負電荷的磷酸根，在電場中會向正極方向移動。不同長度的DNA由于受到凝膠介質的阻力不同，表現為不同的遷移率而被分開。

3．器材

電泳儀，水平凝膠電泳槽和梳子及其制膠模塊，250ml三角瓶，微波爐，臺式離心機，旋渦混合器，凝膠成像系統，分光光度計，微量移液取樣器，1.5ml離心管，雙面微量離心管架，試管架等。

4．試劑

pET-his質粒，pMD18-T-NK載體，TAE電泳緩沖液，1000×溴化乙錠儲存液，電泳級瓊脂糖粉，10×加樣緩沖液（或6×加樣緩沖液），DNA分子量標準（λDNA HindIII: 23130，9420，6560，4360，2320，2030，560，130 bp）。

5．實驗準備

配制TAE電泳緩沖液（50×儲存液，pH約8.5：Tris堿 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，dd water 定容至1L），1000×溴化乙錠儲存液（0.5mg/ml：50mg溴化乙錠溶于100mL dd water，4°C避光儲存），10×加樣緩沖液（20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚藍）；6×加樣緩沖液（0.25%溴酚藍，40%蔗糖水溶液）；1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌）。

6．操作步驟

（1） 稱取0.5g瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE電泳緩沖液(1×)，放入微波爐中燒開（1min）。50ml 正好倒兩塊小膠。

（2） 注意觀察燒瓶中的瓊脂糖粉末，待完全熔化后停止微波爐（切不可讓膠溶液溢出到微波爐中！）。

（3） 戴上線手套，從微波爐中取出三角瓶，置桌面上冷卻致不燙手（約50-60°C）。

（4） 把梳子插到凝膠灌制模具的正確位置后緩緩倒入膠溶液。膠溶液倒至與模具的矮邊緣相平即可，不要把膠溶液溢到外面。在桌面上靜置10-20分鐘待膠完全凝固。（剩下的膠溶液封口后留待以后再熔化使用）。

（5） 在水平電泳槽中加滿1×TAE電泳緩沖液。根據電泳槽的長度把電泳儀的電壓調至170V(10V/cm)，注意正負電極的位置連接正確。

（6） 待膠完全凝固后（15-20分鐘），小心拔出梳子。用手指捏住模具兩側的高邊緣取出模具和凝膠放入電泳槽中間的平臺上，凝膠要沒入電泳液中。凝膠上有樣品孔的一側要朝向電泳槽的負極。

（7） 剪1片光面紙（或封口膜），點6μl蒸餾水、1μl 10×加樣緩沖液，再加入3μl質粒DNA溶液制成10μl DNA樣品。

（8） 在凝膠上選擇相鄰的加樣孔。用10μl的吸液頭分別將管中的樣品加入凝膠的加樣孔中（如果需要時，在相鄰的加樣孔中加入1.5-3μl DNA分子量標準物）。加樣時持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住這只手的手腕，以減少移液器的抖動。看到藍色的樣品吸管尖頭伸進加樣孔后（不能伸得太深，以免穿破凝膠的底部）緩緩將藍色的樣品壓入加樣孔中。切不可使藍色樣品流到孔外。

（9） 打開電源開關，樣品將形成一條藍色的橫帶向前移動（如果發現藍色向后移動，立即關閉電源，調換電極）。電泳將進行約30min。

（10） 當藍色的溴酚藍遷移到距凝膠邊緣1cm時，關閉電源。取出模具和凝膠。

（11） 把凝膠小心反扣放入盛有EB的搪瓷盒中。放置約10分鐘后，取出用自來沖洗兩次。放入凝膠成像系統中拍照。

（12） 清理垃圾。染有EB的凝膠要放到專用的垃圾袋中作專門處理，以免污染環境。