質譜技術在臨床微生物樣本直接檢測中的應用

　　基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是20世紀80年代發展起來的一種新型軟電離有機質譜, 作為一種新興的蛋白質組學檢測技術, 現已廣泛應用于生命科學及相關領域。同時作為一項新興的微生物鑒定技術, 受到了國內外的廣泛關注。與傳統的生化表型鑒定方法和分子生物學方法相比, MALDI-TOF MS具有操作簡單、快速、準確和經濟的特點。早在1975年, ANHALT等[1]利用質譜儀結合高溫裂解技術第1次完成了細菌的鑒定, 從此拉開了質譜鑒定細菌的“ 序幕” 。隨著質譜檢測技術的不斷完善和發展, 近年來, MALDI-TOF MS已經成功應用于微生物的鑒定, 顯示了其在細菌、酵母菌等鑒定方面均具有良好的應用價值。眾多的研究表明, MALDI-TOF MS技術對培養出的純菌落進行菌種鑒定具有很高的穩定性及準確性, 對常見細菌和酵母菌的屬的鑒定率能達到97%~99%, 種的鑒定率也能達到85%~97%; 另外, MALDI-TOF MS大大縮短了細菌鑒定的時間, 而且其成本也較常規鑒定方法低[2, 3]。除此之外, MALDI-TOF MS已經能夠成功地用于部分微生物亞種水平的鑒定和細菌耐藥性的檢測, 但這種方法在大多數情況下是應用于培養出的純菌落的鑒定[3]。

　　如果能夠從臨床樣本中直接檢測細菌/真菌, 突破細菌/真菌培養陽性率低、培養時間長的瓶頸, 為細菌/真菌感染性疾病的診療提供更快、更準確的病原學依據, 將對臨床及時控制細菌/真菌感染性疾病起到更大的作用。國內外學者已嘗試將質譜技術應用于臨床樣本的直接檢測, 并取得了顯著的進展。本文就MALDI-TOF MS技術在臨床樣本的直接檢測應用作一綜述。

一、MALDI-TOF MS檢測原理

　　MALDI-TOF MS技術用于微生物鑒定的實質就是檢測具有屬、種或亞型特異性的生物標志的質量信號, 主要是微生物菌體內高豐度、表達穩定和進化保守的核糖體蛋白。MALDI-TOF MS 儀器主要由基質輔助激光解吸離子源(MALDI)和飛行時間質量檢測器(TOF)兩部分組成。MALDI的原理是用一定強度的激光照射樣本與基質形成的共結晶薄膜, 基質從激光中吸收能量而汽化, 并迅速降解, 使樣本分解吸附, 基質和樣本之間發生電荷轉移從而使樣本分子發生電離; TOF的原理是帶有電荷的樣本分子在電場作用下加速飛過飛行管道, 因為離子的質荷比與離子的飛行時間呈正比, 所以不同質量的離子因達到檢測器的飛行時間不同而被檢測, 以離子峰為縱坐標、離子質荷比為橫坐標形成特征性的質量圖譜。將不同種屬微生物經MALDI-TOF分析所形成的質量圖譜與數據庫中的參考圖譜進行比較, 從而實現對目標微生物種或菌株的區分和鑒定[2]。

二、MALDI-TOF MS直接檢測臨床樣本的流程

　　臨床樣本直接檢測的流程主要包括3個部分:臨床樣本的預處理、樣本上機檢測和對比蛋白質指紋圖譜數據庫得出鑒定結果。由于目前報道最多的臨床樣本是陽性血培養瓶和中段尿樣本, 下面將以這二者為例介紹其直接檢測的流程, 其它臨床樣本的檢測流程與之類似。

(一)臨床樣本預處理

　　MALDI-TOF MS直接用于臨床樣本的檢測有2個基本的要求:(1)臨床樣本中細菌的量。為了得到準確的鑒定圖譜, MALDI-TOF MS技術對置于靶板上的細菌的最低檢測限約為(1× 104)~(1× 106)cfu/mL。若要直接檢測擬似血流感染的血液樣本以及擬似泌尿系統感染的中段尿等臨床樣本中的病原菌, 首先必須富集細菌; (2)臨床樣本的質。由于血液和血培養瓶中的大分子成分如血紅蛋白和其它蛋白成分、尿液中的白細胞等有機成分會干擾細菌的譜峰, 所以直接檢測前需要采取預處理措施去除這些干擾因素。

1.陽性血培養瓶直接檢測 直接檢測陽性血培養瓶的細菌濃度常常需要1× 107 cfu/mL[2, 4]。由于在血流感染患者血液中的細菌量常常很低(最低可< 1~10 cfu/mL), 因此對血樣本的直接檢測需要一個增菌的過程, 即采用血培養瓶增菌。目前已報道的陽性血培養病原菌預處理程序各不相同, 但預處理過程主要包含了以下2個步驟:(1)將細菌從血細胞中分離出來。先應用溫和去污劑(如吐溫-80、十二磺基硫酸鈉、皂素等)將血液中的血細胞溶解, 然后通過不同的流程(離心、洗滌)去除其它的干擾因素, 純化要鑒定的細菌樣本; (2)將菌體中的蛋白質抽提出來。最常用的是混合溶劑處理法, 使用甲酸/乙腈溶液對樣本進行處理來抽提蛋白, 利用2種溶劑的混合作用將菌體表面的蛋白和存在于細胞內的低相對分子質量的高豐度蛋白提取出來, 實現對菌株的鑒定。雖然至今尚沒有規范化的處理程序, 不過目前市場上已有商品化的陽性血培養瓶預處理試劑盒Sepsityper kit(Bruker)可以提高鑒定分數和鑒定準確率, 但是花費比較高, 處理程序也費時較長[5]。另外, HAMMARSTR? M等[6]建立了一種基于聲學捕捉和集成選擇性富集目標(integrated selective enrichment target, ISET)的新方法用于富集樣本中的細菌, 快速、準確并且簡化了人工操作, 有望替代傳統的以離心為基礎的分離方法。

2.中段尿樣本 要取得一個較高的鑒定成功率, 直接檢測中段尿樣本中病原菌至少需要的細菌數量是1× 105 cfu/mL[7, 8]。對尿樣本的預處理程序較為簡單, 主要有下面幾個步驟:低速離心去除白細胞, 高速離心收集細菌, 沉淀, 經過洗滌、離心之后進行蛋白質的提取(常用的是甲酸、乙腈), 經高速離心后取1 μ L上清涂布到MALDI的靶板上, 在室溫下干燥后即可進行檢測。

(二)MALDI-TOF MS分析

　　目前主要有4種MALDI-TOF MS系統[9]:MALDI Biotyper系統 (Bruker Daltonics, 德國), VITEK MS系統 (BioMé rieux, Marcy l’ Etoile, 法國), the AXIMA@SARAMIS 數據庫 (AnagnosTec, 德國)和the Andromas (Andromas, 法國), 其中前2種質譜系統已獲得中國食品和藥品監督管理局許可證, 可以用于臨床樣本的檢測。

　　在進行質譜分析前, 應根據不同的檢測對象和使用的激光類型選擇合適的基質。基質由基質復合物和基質溶劑組成。常用溶劑有:乙醇、乙腈和一種強酸如三氟乙酸、甲酸等。常用的基質是2, 5-二羥基苯甲酸(2, 5-dihydroxybenzoic acid, DHB)、ɑ -氰基-4-羥基肉桂酸(ɑ -cyano-4-hydroxycinnamic acid, ɑ -CHCA)、3, 5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(sinapinic acid, SA)等。將經過提取的微生物樣本細胞內容物與等量的基質溶液(通常是1 μ L)混合或分別點加在樣本靶板上, 待室溫條件下干燥后(使得樣本與基質共結晶)上機檢測即可。

(三)鑒定結果分析

　　將質譜檢測得到的譜峰與數據庫進行模式匹配, 得到一個鑒定分數。基于軟件給出的在列表中第1種微生物的鑒定分數, 根據各自質譜分析系統的判斷標準得出檢測結果。目前文獻報道有2種判斷標準:第1種是由STEVENSON等[10]提出的, 鑒定結果按照匹配程度進行打分, 分值在0~3之間。當得到的鑒定分數≥ 2.0時, 表示待測菌株有較大的把握被鑒定到種的水平; 鑒定分數在1.7和2.0之間時, 表示菌株被鑒定到屬的水平, 分值< 1.7表示產生的鑒定結果不可信。第2種標準是LA SCOLA等[11]提出的, 當一個樣本經過4次點樣鑒定, 當列表中第1種微生物的鑒定結果均一致, 并且至少2次的鑒定結果鑒定分數≥ 1.900, 或者4次的鑒定分數均≥ 1.200, 表明微生物能被正確鑒定。有學者發現通過改進上述的鑒定標準可以得到更好的鑒定效果, ROSSELLó 等[12]認為在臨床樣本直接鑒定時, 鑒定分數要比直接純培養的低, 可能會對分析結果造成干擾, 而廠商推薦的鑒定標準有些嚴格, 只有得到很高的鑒定分數結果才是被接受的。因此提出新的標準增加可接受的準確鑒定數:當一個樣本4次點樣中至少有2次的鑒定結果一致, 并且對列表中的第1個微生物種的鑒定分數均≥ 1.4時, 即表示能夠準確鑒定, 這種標準與純培養的鑒定結果有100%的符合率。NONNEMANN等[5]、GORTON等[13]將種的鑒定分數降到1.5, 可以將種的鑒定率從56%提升到76%、54%提升到63%。以上均提示了廠商推薦的cut-off值比較保守, 使得鑒定的敏感性降低。此外, 由于目前的數據庫尚不完善, 對于部分菌株可能會出現鑒定失誤的情況, 實驗室工作人員應在商品數據庫的基礎上建立和豐富自己的參考數據庫, 以提升鑒定的準確率。

三、MALDI-TOF MS在臨床樣本直接檢測中的應用

　　從臨床樣本直接檢測微生物可以節省轉種培養的時間。目前已取得顯著進展的是從血培養陽性樣本中直接檢測細菌和酵母樣真菌, 而從中段尿和其他無菌體液樣本中的直接檢測也在快速發展。

(一)血流感染病原菌的快速檢測

　　血流感染的發病率和死亡率都相當高, 快速準確的血流感染病原菌鑒定對于臨床抗菌藥物的合理使用和病愈率的提高至關重要。直接檢測能顯著減少鑒定時間(< 29 h), 使得在血培養陽性的第1個24 h內接受適當抗菌藥物治療的患者增加11%[14]。CLERC等[15]認為基于MALDI-TOF MS 對血培養陽性樣本的檢測可能會成為血培養陽性患者管理中除了革蘭染色報告之外的第2個關鍵步驟。近年來, 有不少的研究應用MALDI-TOF MS直接鑒定臨床微生物樣本, 取得明顯進展的是從血培養陽性樣本中直接鑒定細菌和酵母樣真菌[5, 10, 16], 而混合菌和厭氧菌等的鑒定還有待更多的研究。

1.鑒定效能 (1)細菌:在引起血流感染常見菌的鑒定方面, MALDI-TOF MS技術已經在腸桿菌科細菌、葡萄球菌等病原菌的直接鑒定方面取得了很好的鑒定結果。大量的研究評估了MALDI-TOF MS用于直接鑒定陽性血培養瓶的表現, 不同文獻報道的種水平的鑒定率在54%~99%不等[5, 10, 11, 17, 18, 19], 主要是由于所鑒定細菌種類/數量的不同, 或是運用了不同的預處理/提取方法, 或是定義了不同的cut-off值。SCHMIDT等[19]、SCHUBERT等[20]應用不同的操作程序直接鑒定陽性血培養瓶樣本, 結果顯示103株代表臨床最常見的13個屬24個種的樣本中, MALDI-TOF MS準確鑒定其中的72%(86.6%革蘭陰性菌, 60.0%革蘭陽性菌); 500例樣本中, 其中革蘭陽性菌358例, 革蘭陰性菌98例, 總體種的鑒定率達到了86.5%, 其中革蘭陽性菌是89.8%, 革蘭陰性菌是86.3%。國內最新的研究也顯示, 陳峰等[21]運用分離膠促凝管聯合MALDI-TOF MS直接檢測, 革蘭陰性菌和革蘭陽性菌中有84.0%和75.0%能被準確鑒定到種的水平; 對于血流感染中最常見的病原菌的菌種鑒定符合率達到83.3%~96.9%。以上研究均顯示了MALDI-TOF MS在血流感染直接鑒定方面的良好表現, 并呈現出了如下特點:對革蘭陰性菌的鑒定率比革蘭陽性菌高; 無莢膜的細菌較有莢膜的細菌(細胞壁難以破壞提取到足夠的菌體蛋白)的鑒定率高; 混合細菌感染時鑒定能力有限, 多數情況下只能鑒定出其中一種優勢細菌; 對草綠色鏈球菌的鑒定效果較差(鑒定不出, 或將緩癥鏈球菌鑒定為肺炎鏈球菌)[10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20], 需要進行另外的確證試驗; (2)真菌:MALDI-TOF MS在鑒定酵母菌方面有較高的鑒定率。FERRONI等[18]、YAN等[16]的研究表明酵母菌鑒定的正確率可達91%~100%。但是也有學者得到了相反的結果, GORTON等[13]和PAOLUCCI等[22]直接鑒定的正確率只有56%和41%, 可能是因為鑒定使用的血量過少(1.5 mL), 或是在處理樣本的過程中樣本的丟失導致了低鑒定率; (3)其它細菌:目前關于厭氧菌的直接鑒定的報道較少, 并且顯示了鑒定成功率并不理想, 可能是因為厭氧菌對生長條件的要求較為苛刻, 導致增菌的數量達不到要求, 還需要更多的研究來優化其鑒定條件。

2.不同的檢測方法 上述結果均是MALDI-TOF MS直接檢測報陽血培養瓶的樣本所得到的。有研究表明報陽血培養瓶的樣本也可以轉種到固體培養基上進行短暫孵育(如2~4 h)后再進行鑒定, 則具有更大的優勢。KROUMOVA等[23]在質譜法分析實施蛋白提取程序之前, 將樣本富集到一個增菌培養基中孵育大約2 h后再進行質譜分析, 同時達到增菌和減少血液成分干擾的目的, 提升了鑒定分數, 使鑒定結果更可信; IDELEVICH等[24]將血培養陽性的樣本轉種到血平板孵育1.5、2、3、4、5、6、7、8、12和 24 h(對照), 分別直接進行MALDI-TOF MS檢測, 直到有可靠的到種水平的鑒定結果出現(鑒定分數≥ 2.0), 結果發現革蘭陽性球菌平均鑒定到種所需要的孵育時間是5.9 h, 革蘭陰性桿菌平均鑒定到種所需要的孵育時間是2 h。如果增加了蛋白提取程序, 革蘭陽性球菌的孵育時間將縮短至3.1 h, 但對革蘭陰性桿菌的影響不明顯。這種方法可以有效地減少額外的人工操作時間和費用。HONG等[25]的研究也表明, 這種方法能得到可靠的鑒定結果(與傳統生化方法的屬水平的一致率是98.9%), 并且這種方法不會受血培養系統的影響, 成本低, 易于操作。

3.與藥物敏感性聯合檢測 為了克服MALDI-TOF MS不能做體外藥物敏感性試驗的不足, MALDI-TOF MS已經開始與藥物敏感性試驗聯合用來直接檢測陽性血培養瓶的樣本[26], 用不含活性炭的血培養基在過濾和洗滌之前用溶解細胞的緩沖液進行孵育, 然后將從過濾膜上收集的微生物直接進行MALDI-TOF MS分析, 剩下的樣本用VITEK 2系統孵育并進行藥物敏感性試驗, 將94.0%的樣本鑒定到了種的水平, 藥物敏感性試驗與傳統方法相比有93.5%的一致率, 并且相較于傳統的56.3 h, 新方法鑒定和藥物敏感性試驗所用的時間縮短到了11.4 h。證明了在一天內完成微生物鑒定和藥物敏感性試驗的可行性。為獲得更好的治療爭取了時間并且減少了住院的費用[27]。

4.檢測結果的影響因素 有研究指出不同的血培養瓶和血培養系統可能會產生鑒定結果的差異[19, 28, 29]:使用含有活性炭的血培養瓶和BacT/ALERT血培養系統的鑒定率較低, 使用含有樹脂的血培養瓶和BACTECTM血培養系統鑒定率較高。其中一項研究比較了含有活性炭的和不含活性炭的血培養瓶在BacT/ALERT血培養系統下的鑒定表現, 發現使用不含活性炭的血培養瓶的MALDI-TOF MS的鑒定率為30%, 而含有活性炭的血培養瓶的鑒定率只有8%[28]。而另一項研究比較了3種不同的血培養系統— — BACTECTM, VERSATREK和BacT/ALERT對鑒定率的影響, 經這些鑒定系統培養的陽性血培養瓶的鑒定成功率分別是76%、69%和62%[29]。此外, 使用不同的細菌蛋白提取程序也會影響鑒定成功率[11]。

(二)泌尿系統感染病原菌的快速檢測

　　因泌尿系統感染的中段尿樣本中的細菌量相對很高, 中段尿樣本也是MALDI-TOF MS直接檢測的理想選擇[30], 并且常常是單一菌種感染, 避免了MALDI-TOF MS在鑒定混合菌樣本的不足[31]。泌尿系統感染是人類常見的感染性疾病, 臨床泌尿系統感染最常見的病原菌為大腸埃希菌(70%~95%)、腐生葡萄球菌(5%~10%)以及其它腸桿菌科細菌, 如奇異變形桿菌和肺炎克雷伯菌。有研究表明MALDI-TOF MS對尿液樣本中這些細菌的鑒定效率和準確率要優于傳統鑒定方法和其他鑒定系統[7, 32, 33]。

1.鑒定效能 FERREIRA等[7]選取尿液中細菌大于1× 105 cfu/mL的樣本進行直接的MALDI-TOF MS鑒定, 結果顯示尿液樣本經過差速離心法處理后, 可將91.8%的菌株鑒定到種、92.7%的菌株鑒定到屬的水平。

　　楊溪等[33]使用MALDI-TOF MS技術對臨床收集到的1 040份尿液樣本進行直接快速檢測, 共鑒定出含細菌的樣本526份, 其中尿細菌培養菌落數≥ 1× 105 cfu/mL, 培養出1種/2種菌的尿液樣本MALDI-TOF MS的直接鑒定率分別為92.7%(430/464)和75%(96/128)。MALDI-TOF MS直接檢測法的鑒定結果與尿細菌培養法鑒定出的細菌菌種一致, 符合率為100%。

2.與流式細胞術聯用 懷疑泌尿系統感染的尿液樣本一般經離心后取沉淀直接進行檢測, 但考慮到臨床上有60%~80%的尿液樣本是陰性的, 為了減少分析的時間和人工的工作量, 有學者將MALDI-TOF MS與流式細胞術聯用檢測, 用流式細胞術篩除細菌數量不足的尿液樣本, 而MALDI-TOF MS用來檢測篩選結果為陽性的尿液樣本, 取得了良好的鑒定效果[34, 35]。MARCH ROSSELLó 等[34]建立了這樣一種微生物鑒定程序:先用流式細胞儀進行菌落計數篩查出單一細菌陽性的尿液樣本, 然后再進行MALDI-TOF MS檢測, 發現細菌數在1× 107 cfu/mL時是足夠的細菌濃度, 有87.5%的敏感性, 而細菌數在(1× 105)~(1× 107)cfu/mL之間的樣本經過4 h的預增菌, 得到用于分析的足夠的細菌數量后, 可以達到91.7%的敏感性。

3.細菌含量對鑒定結果的影響 由于中段尿中病原菌數< 1× 105 cfu/mL時也有可能預示著尿路感染, ROSSELLó 等[12]研究了不同細菌濃度對直接鑒定準確率的影響, 結果表明大多數情況下細菌數≥ 1× 105 cfu/mL的樣本能產生更高的鑒定分數(接近或> 2.0), 而隨著樣本中細菌數的降低, 鑒定成功的比例和鑒定分數也在下降, 當菌落數< 1× 104 cfu/mL時, 不能得到可靠的鑒定結果; 并且發現在每一個細菌濃度下, 腸桿菌科的細菌均顯示了更高的鑒定分數和鑒定準確率; 革蘭陰性菌的鑒定分數和鑒定成功率要比革蘭陽性菌高, 這與在血樣本直接鑒定得到的結果一致; 對于4株酵母菌樣本, 2個菌落數≥ 1× 105 cfu/mL的樣本能被準確鑒定, 而菌落數在(1× 104 )~(5× 104)cfu/mL時則不能鑒定。而王琳等[36]的研究發現, 單一菌感染且細菌數> 1× 104 cfu/mL的中段尿樣本, 應用MALDI-TOF MS直接檢測即可取得滿意的鑒定效果。

4.中段尿樣本直接檢測的新方法 DEMARCO等[31]近期描述了一種透析過濾的方法, 通過脫鹽、分餾、富集等步驟對100例陽性尿液樣本在MALDI-TOF MS分析前進行了預處理, 實驗結果表明這種預處理方法能夠正確地鑒定陽性尿液樣本, 并且正確分類了所有臨床相關菌尿癥的陰性尿液樣本, 包括一組污染的尿液樣本和一組臨床上無關緊要的定植菌。敏感性和特異性分別是67%和100%。

5.中段尿樣本直接檢測的不足之處 與直接檢測培養陽性的血樣本一樣, 對于含有2種或2種以上細菌感染的中段尿樣本, MALDI-TOF MS常常表現為鑒定能力不足[33, 35]; 尿液蛋白質如α -防御素[8]會造成鑒定結果不能正確匹配數據庫; 對酵母菌的鑒定能力也有待于進一步提高; 對于核糖體蛋白序列差異很小的菌種也常常不能區分。

(三)其它無菌體液

　　MALDI-TOF MS直接檢測和鑒定其它無菌體液樣本如腦脊液、胸腹水和關節液等中細菌的報道尚不多。NYVANG HARTMEYER等[37]首次報道了通過直接將腦脊液樣本離心取上清直接進行MALDI-TOF MS分析, 肺炎鏈球菌性腦膜炎可以在30 min內做出診斷, 為后續治療方案的選擇和結果的解釋提供了重要的參考依據。SEGAWA等[38]也用同樣的方法對一例肺炎克雷伯菌引起的腦膜炎做出了診斷, 但同時也指出在實際應用中能獲得的樣本量少, 細菌數少可能會限制它的應用。另外, 還可將無菌體液樣本轉移到血培養瓶中進行孵育, 待報陽后進行檢測也是可行的。有研究應用MALDI-TOF MS檢測了46份液體, 包括移植養護液、關節液、深部膿皰樣本、骨小孔樣本用血培養基孵育, 發現44/46(96%)能鑒定到種的水平, 余下的2份被鑒定到屬的水平[18]。

四、總結與展望

　　MALDI-TOF MS是一種簡單、快速、高通量和高效的微生物鑒定手段, 在臨床樣本直接檢測方面較傳統的鑒定方法具有更大的優勢, 能顯著降低樣本檢測的周轉時間和成本, 但尚存在著一些不足之處, 主要表現在:(1)MALDI-TOF MS在檢測和鑒定細菌方面的敏感性還不高, 不能直接鑒定患者血樣本中的病原菌(細菌數量太少); (2)對于一些核糖體蛋白差異較小的細菌用其辨別有較大的困難; (3)目前的研究都有各自不同的操作過程, 在樣本處理、質譜圖采集和分析等方面沒有統一的標準, 可能會影響分析結果在實驗室內和實驗室間的可重復性; (4)標準的鑒定參考圖譜數據庫尚不夠完善, 需要進一步拓展; (5)對一些細胞壁難以破壞的細菌(如革蘭陽性菌、酵母菌)和混合菌等的鑒定能力還不夠高。但是相信隨著更加有效的樣本預處理方法、更加嚴格的檢測過程控制和更高分辨率的圖像處理技術的實現, MALDI-TOF MS用于直接檢測臨床樣本中的微生物會有更廣闊的前景。