質譜沙龍第十八期活動報道

　　2009年4月25日下午，質譜沙龍第十八期活動在解放軍307醫院實驗樓舉行。來自二炮總醫院、AB公司、朝陽醫院、空軍總醫院、清華大學醫學院、中科院動物研究所、解放軍307醫院的各位專家、學生20余人。

　　第十八期質譜沙龍活動現場

　　307醫院藥物臨床試驗機構副主任 劉澤源博士

　　報告前，由307醫院藥物臨床試驗機構副主任劉澤源博士，向大家介紹了該院藥學部臨床藥理研究室，創建于1980年，是全軍首家成立的臨床藥理學科，也是全國最早建立臨床藥理學科單位之一;1986年，被國家衛生部批準為國家臨床藥理基地，是全軍第一個國家級藥理基地。

　　本網收錄前沿Lab：解放軍三零七醫院藥學部臨床藥理室

 

　　液相色譜梯度方法的開發及其在質譜定量技術中的應用

　　報告部分首先由第二炮兵總醫院藥劑科李鵬飛老師跟大家一起探討了《液相色譜梯度方法的開發及其在質譜定量技術中的應用》。

　　第二炮兵總醫院藥劑科 李鵬飛老師

　　李鵬飛老師根據自己的工作經驗指出，在實際質譜分析中，有時通過優化質譜參數、改善前處理方案還不能提高靈敏度，這時就需要采用液相色譜梯度方法，并優化合適的梯度，利用該方法也可以有效地利用液相分離復雜體系。

 

　　梯度洗脫的含義及特點

　　梯度洗脫又稱為梯度淋洗或程序洗提，在液相色譜中流動相由幾種不同極性的溶劑組成，通過改變流動相中各溶劑組成的比例改變流動相的極性，使樣品中的所有組分可在最短時間內實現最佳分離。優點是單位時間的分離能力增加；檢測靈敏度提高；使樣品與溶劑前沿基線分離，降低基質干擾。

 

　　梯度的洗脫方式

　　常見的雙元（或更多元）梯度洗脫具備高壓梯度和低壓梯度兩種方式，前者利用雙泵流速控制流動相溶劑的比例，準確率高且穩定，梯度延遲比較小，但通常由于購置時未配置脫氣機，可能還會殘留一些氣泡，另外由于購置經費的限制，一般配置到兩元，更多元數的購置成本就過高了；后者采用單泵方式，利用分流閥控制流動相比例，混合后再進行在線脫氣，所以一般能消除氣泡，另外通常可配置為4元，但相比高壓梯度的缺點是：準確率低而且死體積比較大，梯度延遲比較嚴重。

 

　　梯度洗脫的可變參數

　　梯度曲線

　　如圖中所示6號曲線稱為等梯度，2、3、4、5號曲線為凸形曲線，7、8、9、10號曲線為凹形曲線，它們被稱為非線性梯度。在有機相和水相固定的前提下，水相的強度不應太弱，有機相的強度不應太強，通過改變梯度的陡度及形狀，可以對多組分的化合物進行有效地分離。梯度曲線下的面積越大，洗脫能力越強。

 

　　梯度洗脫步驟的建立及應用

　　為了使樣品的混合組分有效的分離，掩蓋住雜質峰的干擾，一個合理的梯度洗脫方法建立是十分關鍵的。首先確定好水相和有機相以及色譜柱，先采用等度的洗脫方式（即采用6號線）試驗，看是否能達到理想的分離效果，如不理想則需要使用梯度洗脫方式。

　　如果譜圖上接近 t₀ 處顯現譜帶擠在一起，則需要降低初始水相的強度；若譜帶遠離色譜圖的開始部分，則應增大水相的強度。

　　如果需要洗脫很長時間，則應增加有機相的強度；反之所有的譜帶都在比較靠前的位置被洗脫，則應降低其強度。

　　如有必要可以調節斜率，為增大靈敏度可以增加斜率，為增大分離度可降低斜率。解決具體問題，比如溶劑分層，沒有有效的弱溶劑時，可以用梯度延遲來解決譜圖前部分離度不佳的問題。

　　通過選擇梯度曲線凸線或凹線形式，來達到理想的分離效果。當譜圖中譜帶聚集到一起要使它們分開時采用凹線(即7、8、9、10號線)；當遇到譜帶分離太散時考慮采用凸線(即2、3、4、5號線)來縮短分離時間。同時還要考慮到梯度平衡時間以及有機污染物對梯度洗脫的影響。

　　接下來，李鵬飛老師例舉了一個含有9個烷基苯酮化合物梯度方法的開發實例。利用上述的梯度洗脫方法的建立步驟，最終達到了理想的分離效果。

　　最后，李鵬飛老師簡單地介紹了液相色譜分析中各種梯度洗脫方式是如何實現的。

      本網收錄前沿Lab：第二炮兵總醫院分析中心

　　報告下載： 《液相色譜梯度方法的開發及其在質譜定量技術中的應用》

 

　　華法令的質譜檢測及相關藥物基因組學研究

　　來自朝陽醫院藥劑科張征老師為大家介紹了《華法令的質譜檢測及相關藥物基因組學研究》的報告。

　　朝陽醫院藥劑科 張征老師

　　華法林/華法令是臨床常用的口服抗凝藥物，機理就是通過抑制凝血因子的活化從而抑制新的血栓形成。該藥抗凝效果的指標是凝血酶原時間(PT)以及國際標準化比率(INR)。適應癥包括肺栓塞、冠心病、瓣膜病、非瓣膜病性房顫和深靜脈血栓。華法林也是第一代抗凝血殺鼠劑，是維生素K的競爭性拮抗劑。

　　華法林在臨床上存在許多問題，例如個體差異比較大，不同病例的日口服劑量差別很大；治療窗窄即國際標準化比率目標值需要達到2.0到3.0之間，才能保證出血風險降到最低，由于范圍很窄所以調整劑量時間比較長，如果調整不好會帶來很大的出血風險。

　　為了解決這些問題。臨床上普遍采用藥物基因組學的方法，簡而言之就是利用基因組學的方法在一組人群里把具有特殊基因多態性的人群挑選出來，對他們改變劑量或使用其他藥物，因為這類人群由于基因型存在顯著的不同，造成服用同種藥物或相同劑量的情況下無效或中毒。

　　華法林給藥劑量與病人年齡、體重、種族、血漿維生素K水平、飲食、基因多態性等因素相關。

　　影響華法林代謝的基因有30多種，可分為藥動學和藥效學兩類相關基因，經研究證實其中CYP2C9和VKORC1在基因因素里是最強的影響因子。

　　華法令結構式中具有一個手性C原子，形成一對對映體，S-對映體的體外抗凝活性為其R-對映體的6～8倍，體內抗凝活性為2～5倍，此差異可能的解釋是S-對映體的蛋白結合率較R-對映體高。S-華法林在人體內主要進行7-羥化代謝，是由CYP2C9形成的;而R-華法林則主要進行6-羥化和酮基還原反應，是由于CYP3A4、 CYP1A1、 CYP1A2形成的。

　　由于這些影響因子的作用，2007年8月16日，美國FDA宣布批準了warfarin說明書的修改，強調CYP2C9和VKORC1基因變異導致35～50%的患者對華法林反應存在個體差異，需要更低的起始劑量。

　　最后張征老師簡單地介紹了把華法林作為一種鼠藥中毒物質所完成的質譜檢測分析，列舉了檢測中質譜條件、色譜條件以及血漿樣品前處理分析數據。條件簡述如下：液-液萃取法，C18柱，負離子檢測。實驗結果為：血漿中華法令在0.40～200 ng·mL^-1濃度范圍內與峰面積比線性良好，定量下限（LLOQ）為0.40 μg·mL^-1，其準確度和精密度符合要求 。

　　報告下載：《華法林的質譜檢測及相關藥物基因組學研究》

 

　　串聯質譜在藥物代謝中的應用

　　來自AB公司的張克榮工程師為大家介紹的報告內容是串聯質譜在藥物代謝中的應用。

　　AB公司 張克榮工程師

　　隨著我國對創新藥管理日益嚴格，加強對體內活性代謝產物及毒性代謝產物的鑒定是一個必然的發展趨勢。

　　張工程師首先介紹了目前鑒定代謝產物的分析過程。一般是采用質譜技術分析空白樣品和給藥后的生物樣本，比較得出他們之間的差異離子，對這些差異離子進一步進行結構解析初步確認代謝產物，制備該產物的對照品通過核磁共振確定其結構，比較對照品和代謝產物在質譜和液相分析中行為是否一致，從而最終確定其結構。

　　在分析儀器方面，采用三重四極桿質譜系統的中性丟失掃描和母離子掃描技術尋找代謝產物，通過全掃描靈敏度較高的離子阱質譜技術進一步確認，也可利用具備高分辨率的Q-TOF技術確定分子量信息。串聯質譜和離子阱質譜技術可以完成80%的鑒定工作，Q-TOF質譜只占到5～10%的工作量。

　　AB公司推出的Qtrap型質譜系統結合了三重四極桿和離子阱技術，并提供多種掃描方式，在代謝物分析的實驗中可以更好地幫助研究者開展工作。接下來張工具體介紹了Qtrap技術在鑒定藥物代謝產物的分析流程。

　　首先在進行鑒定工作之前，要對藥物代謝產物有一定的認識，藥物進入人體后在酶的作用下將產生一相代謝物和二相代謝產物，在二相代謝產物中比較關注的比如帶有毒性的谷胱甘肽產物。

　　二相代謝產物主要是結合體內一些內源性物質而產生的，其質譜特征很有規律，可以通過中性丟失掃描和母離子掃描技術來尋找。

       而一相代謝產物是由于氧化還原形成的，質譜特征不是很規律，情況比較復雜，除了采用中性丟失掃描和母離子掃描技術，有時還需要采用一級全掃描技術尋找可能的代謝產物，對于一些低含量的代謝產物還可以通過特異性較強的MRM方式進行篩查，比如：AB公司推出的pMRM技術。所謂pMRM可理解為“預見的MRM”，即從理論上預知各種形式代謝產物可能出現的離子對，再進行高靈敏度的MRM實驗，該軟件應用十分簡單，在很大程度上降低了分析人員的工作量。

　　在以上工作流程的基礎上，Qtrap系統還可以設置由MRM觸發做二級全掃描，通過更豐富的碎片信息來確證代謝產物，并進行代謝產物的結構鑒定工作。AB的LightSight?Software2.0軟件還可以自動分析出空白樣品和給藥后的生物樣本的差異離子。

 

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