質譜沙龍第十四期活動報道

    2008年11月30日下午，質譜沙龍第十四期活動在中國食品發酵研究院會議室舉行。來自發酵研究院、清華大學、二炮總醫院、朝陽醫院、北大醫學院、北醫三院、安貞醫院、空軍總醫院、中科院植物所、中科院過程工程所、AB公司的各位專家、老師、學生20余人。

 

食源性低聚肽簡介及其功效成分探索

    首先由中國食品發酵工業研究院 功能食品中心的金振濤 介紹他們的一個課題，展示了思路、研究方法、遇到的問題、解決方法、設想等等。

中國食品發酵工業研究院功能食品中心 金振濤：食源性低聚肽簡介及其功效成分探索

    金老師首先介紹了概念：食源性低聚肽是以動、植物食物蛋白源為原料，經過生物酶水解、分離、精制得到的小分子蛋白（肽）的混合物，是存在于動物、植物、微生物體內的天然生物活性肽和蛋白質降解后產生的外源性生物活性肽，其次闡述了食源性低聚肽的生理特點和應用優勢。目前，與中國食品發酵工業研究院技術合作的企業所生產的低聚肽的種類有：植物肽、海洋肽、動物肽及其它低聚肽。有些研究者開展了食源性低聚肽的生理活性研究，如臨床測試、動物實驗、體外實驗等；而金所在的課題組正在進行食源性低聚肽的功效成分研究，這次的報告也主要介紹了他們的一些探索性的嘗試。（筆者注：聽起來有點像中草藥的功效成分研究，所以可想而知研究的難度是很大的）。

    下面的介紹中，都以海洋膠原肽作為研究對象，他們采用了幾種方法：各級色譜逐步分離、肽指紋圖譜鑒定、LC-MS-MS鑒定。

1、技術路線一：各級色譜逐步分離

     該法是當前研究低聚肽功效成分最常規方法，文獻中最多采用，已相繼報道出上百種具有抗氧化、降血壓等不同功能的活性單體。經過如下圖所示的實驗流程，發現：膠原肽分子量整體在1000Da以下，且分布非常集中，成分復雜，用分子排阻色譜無法實現有效分離，用離子交換色譜能實現部分分離，但上樣量較小，較難收集大量洗脫峰組分，不利于活性測定。

 

2. 技術路線二：肽指紋圖譜鑒定

   文獻已報道多種活性結構，他們提出了食源性低聚肽功效成分研究的新思路——肽指紋圖譜鑒定。即通過高效液相色譜分離優化出最佳肽譜，之后以文獻中報道的活性肽結構做為標準品來反復比對，從中找出具有高降血壓、抗氧化、降血脂等功能的活性片斷。目前，他們用標準品，分別鑒定了R-GSH、L-肌肽，并證明具有較高的相似度，正在準備開展MALDI-TOF的實驗。在這種探索中，他們也提出了幾點思考和疑問：比如當前用HPLC峰純度指數鑒定的可信度，以后收集液相峰用MALDI-TOF鑒定的可行性，膠原肽極性較大難分離，二維液相分離的可行性等問題。

3. 技術路線三：LC-MS-MS鑒定

    質譜沙龍活動曾有兩次介紹了iTRAQ試劑在氨基酸鑒定中的應用，因此，研究小組也探索用該方法，篩選和鑒定游離的氨基酸和小肽（如二肽），二炮醫院的李鵬飛老師在其中也合作進行了一些探索，初期探索以二肽作為研究對象。他們的方案是：

• 將20種氨基酸任意組合列出400個二肽，整理成表，以分子量由小到大排列，20個一組分成20組。
• 每一組分別通過二級質譜進行分子量篩選（115，145+肽分子量），找出可能存在的分子量以及一些結構信息。
• 將找到的可能二肽結構與已知活性肽對比，得出可能活性肽信息。
• 進一步探索其結構。

     在應用該方法時，他們還改進了方法，比如原來用MRM，希望在子離子中可以檢測到除115外的更多離子，但比較困難；后來從MRM篩選改為母離子掃描，通過質量的差值（母離子-115）來推斷大概是何種二肽。

    這個工作還處于探索階段，所以演講人在這里也向大家征集意見，到場的幾位專家給出了很多建設性的意見。比如，關于如何從動物凝膠里提取具有生物活性的多肽，來自于過程工程所的張貴鋒 博士介紹了三種方法。第一種，把各種混合的東西分開，但難度很大，因為膠原蛋白降解后親水性很強，用反相分離時一個色譜峰中還有很多未分開的組分；所以最好是用多柱多維，但工作量很大，因為需要分離出甚至幾千種物質，再分別測定其生物活性。第二種，是用細胞實驗的方法。第三種，是借助生物信息學的研究工具，從膠原蛋白的序列找出結構域跟已知功能蛋白一樣的，作一個功能配體親合連在介質上，做成親合層析介質，再把凝膠蛋白過柱、吸附、脫附、洗脫，然后再用質譜測或生物活性鑒定。張博士的實驗室曾利用親合柱的方法簡化候選的多肽，比如可用纖維連接蛋白連接到介質上作為親合介質，得到了6種多肽（2006年質譜學報增刊 “阿膠中特異性多肽的分離與液質聯用分析”）。

相關文章：1、阿膠中特異性多肽的分離與液質聯用分析   2、高效液相色譜質譜聯用法識別明膠動物來源 

   而如果想采用第一種方法，也可以使用張博士所在的實驗室開發的多維層析系統，共有12根柱子，可切換，使混合物得到更好地分離。張博士也誠懇地指出，現在報告者課題組面臨的主要問題，主要是如何在復雜的體系中篩選有活性的肽，而表征相對是靠后的工作，也不是特別困難的。

    也有專家們指出，二肽、三肽用MALDI-TOF會比較難，但可以考慮用離子阱液質，最近的ETD解離技術也可以試試。也有人提出可以提高質譜的分辨率，去更精確地找到母離子掃描中一級質譜的母離子的質量，從而推斷是哪種二肽。

    這里，筆者也衷心祝愿他們的研究能夠盡快地取得突破性進展。

報告下載：食源性低聚肽簡介及其功效成分探索

 

如何提高靈敏度——液質聯用高技術在藥物代謝動力學中的應用

    很多質譜的用戶最初關注的是如何會操作、使用儀器；在熟悉了以后，更多地會關注在實際工作中如何提高靈敏度。所以，二炮醫院的李鵬飛老師，為大家總結介紹了一個非常適用的報告，這個報告的主要思想來源于吉林大學的王英武老師，一些原理是普適性的，但優化的主要目標是面向做藥代動力學的用戶。

二炮總醫院藥劑科 李鵬飛：如何提高靈敏度——液質聯用高技術在藥物代謝動力學中的應用

    首先，從紫外和質譜檢測器各自的原理入手，介紹了質譜的選擇性，比如質譜可以有XIC（提取離子流色譜圖，可以分離出在色譜同一時間出峰，但質量不同的離子）。然后從4個方面介紹如何提高靈敏度：樣品處理過程、進樣量、HPLC條件的優化、MS條件的優化。

1、在樣品處理方面，主要有三種方法：液液萃取、固相萃取SPE、沉淀蛋白法。也可以用一種反提的方法，適用于極性大的化合物，先用有機溶劑沉淀蛋白后，把上清液用另一種有機溶劑反萃取，再分離出水相，因為極性大的待測物主要在水相。

2、進樣量的影響：雖然進樣量增大一般會提高靈敏度，但色譜柱的容量有限，由于“柱頭效應”的影響，會導致色譜峰變寬甚至形成平頭峰，所以一般進樣量不宜過大，一般來說，反而是越小越好。

3、HPLC條件的優化

    色譜柱的選擇：在液質聯用中，可以用很短的柱子（比如5cm或2cm），不僅節省流動相用量，還縮短了分析時間。另外，使用短柱也能提高靈敏度，只要和前面峰分開，使用短柱可以減少峰的擴散，一定程度上提高靈敏度。應針對不同的分析物選擇相應的色譜柱，這時，可以問色譜柱的供應商要一些應用資料、另外，利用庫檢索、文獻等都能更好地選擇色譜柱。

    在保證好的分離的情況下，流動相中有機相的比例稍提高一些，可以使峰形變窄，靈敏度更高。流動相中也可以加入一些化合物（如甲酸等）提高信號靈敏度；另外舉了一個例子，在做負譜時，用氨水將pH調到10左右，靈敏度會提高。

        流動相中不能有不可揮發的鹽（如磷酸鹽），有些在HPLC中使用的掃尾劑如三乙胺和三氟乙酸都會影響質譜的響應信號，一般質譜只能忍受萬分之幾（如萬分之五）的這類試劑。

      有機相比例和流速的影響。質譜屬于質量型檢測器，而紫外屬于濃度型檢測器。對反相色譜而言，提高有機相比例色譜峰會提前，UV峰面積不會變化，但MS的峰面積會增加（一般，有機相比例適度提高會增加離子化效率，從而導致峰面積增加）。提高流速，對UV而言，因為濃度變小（樣品被稀釋），所以會減小峰面積，峰高也不會增加；而對質譜，提高流速會使峰形變窄、峰高增加（靈敏度增加）。為了更好地說明這一點，李老師用對比實驗演示了這種效應。

      梯度的影響：一般，如果體系不復雜，采用等梯度洗脫，分析速度會快；這是因為：（1）梯度洗脫時，樣品之間要有平衡時間；（2）梯度洗脫時，液相色譜的梯度也有梯度延遲（一般會有零點幾分鐘左右）。如果采用梯度洗脫，不能用太短的柱子，比如要用到10cm以上的。另外，梯度上升時，基線會增高。要把樣品峰出峰時間放在梯度上升完之后。做實驗時，要考慮梯度延遲的時間。

    另外還介紹了柱溫的影響，并要注意柱子的疏水崩塌現象。

4、質譜條件的優化：
    MS條件的優化主要目的是盡量提高待測物的質譜響應信號。主要參數有ESI噴霧電壓、APCI的電流、DP值、碰撞能量，霧化氣輔助氣的流速，離子源的溫度。

    雖然各個儀器的參數不大一樣，但優化的過程都是類似的：首先用針泵進樣，來優化質譜各參數；然后不接柱子，用流動相、LOOP環進樣來優化參數。優化好后，再用實際柱上進樣來做實際的樣品。李老師還演示了ABI質譜優化的一段小視頻，大部分電學參數儀器會自動優化。

    質譜的分辨率也會影響信號強度。在背景干凈時，可以把分辨率降低，會采集到所有的同位素峰，信號強度會增大；但如果背景較“臟”，應提高分辨率，減少背景的干擾。

    采集速度也會影響，基本原則是一個色譜峰要采集到足夠的點；這在多個樣品同時測定，幾乎同時出峰（或超快液相）時需要更加注意，既要采集到各個峰，又要在每個樣品峰上采集到足夠的點。

     筆者注：這些經驗性的探索，非常實用，但也需注意，各種應用、使用各類儀器的用戶參考這些經驗的前提是：前面提到的經驗多是固定其它條件來考慮的，實際實驗中還應考慮更多的影響因素（比如離子化效率、基質效應等）。另外，這些經驗對做藥代動力學的用戶最有用，對于其它LC-MS應用（如蛋白質組學、藥物多殘留檢測）有一定幫助。這里主要針對的質譜是ABI的質譜。

報告下載：如何提高靈敏度——液質聯用高技術在藥物代謝動力學中的應用

 

QTrap 5500和三重四極5500型質譜儀
——更快、更靈敏、多殘留測定更方便，且大大增強了阱的性能

    AB公司10月全球推出了5500儀器，并于11月在中國召開了新品發布會，大家對這款新儀器的熱情非常高，雖然是最后一個報告，但大家聽得非常專注。AB公司質譜產品部的技術經理李立軍為大家介紹了最新的Qtrap 5500的特點。Qtrap 5500的功能已把三重四極桿的5500功能都包括了，所以李工重點介紹了Qtrap 5500。

AB公司質譜產品部的技術經理李立軍：QTrap 5500和三重四極5500型質譜儀

    首先介紹了外觀和體積，體積小巧是5500相對以前儀器非常重要的改進。

    5500集所有附件為一體。面板有切換閥，下面有一個預留的位置，可以供客戶再裝一個閥。離子源在中間，右邊是針泵（向上走），右上邊是儀器狀態顯示燈。 體積比前幾代型號減少了44％。

    ABI還能提供給5500一個箱子，把機械泵、氮氣發生器都做進去，可以減少噪音和總的占地體積。

ABI 5500系統在硬件上的六大技術創新 

一、接口的改進：提高了QaQ/MRM靈敏度
使用了QJet離子導向技術（注：在API 5000之前的型號，使用的是Skimmer），

接口的改進

• Orifice直徑為0.62 mm，QJet長12.5 cm，孔徑4mm，IQ0入口孔徑為1.7 mm；
• 四極桿加上高達1.228 MHz的RF頻率，提高了能有效聚焦離子的電位，低質荷比的離子傳輸效率有極大的提高，雖然5500 的m/z范圍為5～1000 amu，但靈敏度更高。
• 同時，減小碰撞室、IQ2和IQ3聚焦孔徑，相對地提高了分子泵在分析區域的抽力，當進行MS/MS掃描時，也提高了分析器的真空，從而提高靈敏度。

二、創新的QJet?-2離子透鏡，極大地提高了系統的靈敏度，改善了真空的分配
 
    QJet-2離子透鏡用于聚焦來自離子源的離子，在四極桿上只加RF射頻電壓；大孔徑設計使更多離子能進入質量分析器；用氣動學原理和RF射頻電壓將離子捕獲，并聚焦進入質量分析器的高真空區域。這是提高靈敏度的基礎。

QJet-2實物圖

三、創新的彎曲的LINAC碰撞室，提高了離子傳輸速度，增加了離子容量，改善了質譜數據質量

核心結構圖 

    Q2是彎曲的LINAC碰撞室，它提高了LINAC軸向電場，所以具有更快的離子傳輸能力。優勢在于：（1）減小儀器體積，減輕分子泵的壓力（只需一個分子泵）；（2）彎曲碰撞室設計可極大地降低中性物質的進入；（3）硬件的改進以及新的線性加速器的設計，再結合軟件和電子學的完善，在進行MRM實驗時，具有更短的停頓時間和駐留時間，同時不降低質譜數據質量（比如時間即使為幾個毫秒，靈敏度不下降）。比如通常，Q2的電壓為50V，相比以前儀器的1.9V，可以使離子獲得更快的加速。

四、提供了線性加速的離子阱Linear Accelerated? Trap：更快的掃描速度，更快的分析時間
 

線性加速的離子阱

    提高線性離子阱靈敏度的原因來自于：
（1）線性加速離子阱技術，是在線性離子阱內增加一軸向電壓，目標離子在掃描前更向萃取區域集中（離子被濃縮）。
（2）改善散射場：在離子萃取區適當增加一定相輔助射頻電壓

    譜圖質量更高、離子阱內的質譜碎片更豐富的原因來自于：
（1）脈沖氣的引入能更快地冷卻離子
（2）脈沖氣和更高的RF電壓，能在很短的離子激活時間內在離子阱內產生更豐富的離子碎片信息

    以前的Qtrap3200和Qtrap 4000，離子阱的掃描速度為4,000 amu/sec，Qtrap 5500提高到20,000 amu/sec。

    更短的離子阱碎片掃描時間，以前是幾個毫秒，現在可到50微秒

優點：

• 更高離子容量的線性離子阱
• 靈敏度提高（阱的掃描靈敏度提高了100倍）
• 掃描速度提高5倍（20,000 amu/sec）
• 離子填充時間縮短20倍
• 分辨率提高2倍（優于12,000）
• 質荷比精度提高3倍

五、創新的AcQuRate?脈沖離子計數檢測器：確保系統的重現性和精確性
 
脈沖離子計數器是在某一時間內檢測離子碰撞到電子倍增器時產生的離子脈沖，輸出一與離子流相關的數字信號。它與模擬檢測器相比，更不容易受背景噪聲的影響；而且不需過濾信號。

    在不同濃度點的重復性非常好。比如在1～100 fg/uL的極低濃度下，如果用模擬檢測器，精密度很差，CV甚至達到40％，而用了脈沖離子計數器，CV總在3％以下。所以，脈沖離子計數器不僅非常靈敏度，同時還具有極高的精密度。

六、創新的eQ? Electroics電子系統：確保快速掃描，ESI的快速正負切換

    eQ電子系統的設計，使串聯四極桿的速度提高了四倍而不降低靈敏度；碰撞室采用動態軸向設計；母離子掃描和中性丟失掃描的性能沒有降低。

    極大的優點是提供更快的MRM速度：

    我們知道，MRM的速度跟幾個因素有關，掃描速度、離子駐留時間（dwell time）、MRM切換速度，有時需考慮正/負離子切換速度。

    MRM實驗中掃描的是一個質量數，所以掃描速度（2,000 amu/sec）已經遠遠超過了MRM實驗的要求；過去制約速度的瓶頸是離子駐留時間，過去常需要幾十毫秒，如果過短，數據質量會受到影響。對于MRM切換速度存在同樣的瓶頸。

    5500的創新設計使其即使在2毫秒的駐留時間、2～3毫秒的MRM切換速度下，不降低數據質量，因此真正解決了當前MRM速度的瓶頸。同時，具有更快的ESI正負極性切換速度（50毫秒）。

    整體性能上，在MRM方面，一次實驗可檢測2500對MRM離子，一個時間段內可檢測1000對MRM離子，同時不降低數據質量。

多殘留檢測的領先者：2003年100對MRM，2005年300對MRM，2008年>750對sMRM
 

    綜合起來，得到一個無與倫比的高靈敏度和高速度。具體的指標沒有給出，但顯示了幾張圖：MRM實驗，5 fg利血平，信噪比S/N 為57:1；on column柱上進樣，10 fg利血平，信噪比S/N為23:1。

s-MRM（scheduled MRM），提高了定量分析的效率

    最后，還介紹了多殘留檢測，一個幫助用戶快速設定方法的、極為有用的功能S-MRM（scheduled MRM，編程的MRM），它是Analyst 1.5的新功能，不僅用在5500上，還可以幫以前的用戶做升級。

它的特點為：

• 每對MRM離子的檢測只在相應的色譜保留時間內進行
• 每對MRM都有最恰當的循環時間和駐留時間
• 使定量分析的重現性和數據的可靠性有保證

    這種智能邏輯優化將大大提高多殘留測定方法的開發速度，把標準品做一遍后，可以由軟件s-MRM自動優化，具體做法是：在第一次實驗中，用戶提供MRM相關信息（比如各個子、母離子對的質量），目標色譜峰的大致保留時間（不要求特別精確），希望駐留多少時間等信息。然后儀器就會自動優化，存儲為方法，下一次實驗就可以很方便地調用該方法了。這項功能將大大減輕多殘留測定用戶的負擔，使開發變得更容易。