蛋白酶K（Proteinase K），相對分子量約為29.3 kDa, 是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。可切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，應用廣泛，可用于制備脈沖電泳的染色體DNA，蛋白質印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶等實驗，蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg /ml。因蛋白酶K在變性劑如SDS（1%）中可提高其活性，所以在使用中，常根據所用緩沖液是否含有SDS、尿素、pH、溫度等因素確定具體的工作濃度。蛋白酶K在較廣的pH范圍內（pH 4-12.5）均有活性。
蛋白酶K有兩個Ca2+結合位點，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機理并無直接關系。然而，如果從該酶中除去Ca2+，由于出現遠程的結構變化，催化活性將喪失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染核酸制品的蛋白質。所以，蛋白酶k消化過程中通常也加入EDTA（以抑制依賴于mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化對蛋白酶k具有較強耐性的蛋白，如角蛋白一類，則可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至終濃度為2mmol/l，以鰲合Ca2+。
運輸和儲存
冰袋運輸，-20 ℃保存，可以保存12個月。避免反復凍融。
使用方法
1. 配制蛋白酶K溶液：一般以20mg/ml濃度配制蛋白酶K溶液。將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml dd水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。
2. 根據終濃度50—100μg /ml，吸取適量蛋白酶K溶液，到待消化樣品中，孵育溫度為55至65℃，理想孵育溫度為58℃，孵育時間為15分鐘至48小時；理想孵育時間為2小時。推薦反應緩沖液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。
注意事項
蛋白酶K在原位雜交技術中通常用于雜交前的樣品處理，它具有消化包圍靶DNA蛋白質的作用，能增加探針與靶核酸結合的機會，提高雜交信號。但蛋白酶K的濃度過高、消化時間過長或孵育溫度過高時，都會對細胞的結構有一定的破壞，導致組織切片的脫落，細胞核的消失，從而影響雜交結果。EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用，解決上述出現的問題，并能達到理想的染色效果。
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