超分辨率顯微鏡實現自由運動神經環路高分辨成像

　　提到在體小動物神經成像，人們自然會聯想到鈣離子熒光探針局部注射或遺傳鈣指示劑（如Gcamp家族）結合雙/三光子顯微鏡的經典在體成像組合。

　　隨著基因改造技術的突飛猛進，通過病毒轉染和轉基因技術，在神經元內源性表達“基因編碼類鈣指示劑（genetically encoded calcium indicator, 簡稱GECI）”成為神經元鈣成像的大趨勢。這種由神經元自身產生鈣指示劑的方法與之前的鈣染料技術相比有著巨大的優勢: 信噪比提升了一個數量級；對神經元特異性好，可以區分不同的神經元類型；并且可以在大腦神經元內持續表達數月（病毒轉染）甚至整個生命歷程（轉基因動物）。另一方面雙光子成像本身具有高分辨率、高通量(高速)、非侵入、成像深度大等特點，與熒光蛋白以及熒光染料等標記物在細胞中的定位與表達技術相結合，能夠在生命體和細胞仍具有活性的狀態下對其功能進行動態觀察，使得人們可以研究處于生理狀態時的動物大腦內的神經元活動。

　　大概10年前開始，科學家就開始利用雙光子成像結合 GECI 技術對神經元的活動和結構變化進行長期的觀測和追蹤，從而對記憶的形成，神經元病變等問題有了更深入的認識。其中，現在性能最好，使用最為廣泛的 GECI 為綠色熒光鈣調蛋白 Gcamp 家族。目前已經改進到第六代，Gcamp6f，Gcamp6f 已經成為神經成像里最受歡迎的指示劑之一。目前科學家最流行的對小動物行為過程中大腦活動進行成像的方法，是將虛擬現實與雙光子成像相結合，在動物頭部被固定的情況下，在其眼前制造影像，讓動物認為自己處在”真實“的環境之中。通過小鼠四肢在類似跑步機或者鼠標滾球上的運動來模擬其真實活動。以求達到研究神經元在動物行為中所起到的作用（如圖1）。

圖1 雙光子成像結合虛擬現實場景，對頭部固定，身體活動的動物進行研究。圖片來自1

　　然而，這種虛擬現實加頭部固定成像的方法，已經遭到許多科學家的質疑。人們認為，頭部固定的動物在實驗期間一直處在物理約束和情緒壓力下，因此無法證明神經元對外界的響應在虛擬現實和自由探索下是等價的。更重要的是，許多社會行為，比如親子護理，交配和戰斗，都不能用頭部固定的實驗來研究。如何在動物自由活動的時候，直接對其神經元進行成像，是神經科學家還未能得到解決終極的訴求。

　　一個理想的解決方案是開發微型熒光顯微鏡直接固定在自由活動的動物身上，讓動物“帶著顯微鏡跑”2。起初，科學家只是將一根或幾根光纖插到小鼠頭上，用以激光導入和熒光信號采集。然而，這種方式而只是記錄某個區域內信號的總和，不具有空間分辨率，算不上真正意義上的成像。在最近的十幾年里，由于光學，電子，材料技術的發展，人們開始嘗試研制真正意義上的微型顯微鏡。其中，微型單光子寬場顯微鏡（miniature wide-field microscope），由于其原理與結構相對簡單，是目前人們主要嘗試研制的微型顯微鏡技術。例如由Ghosh及其同事開發的顯微鏡，通過將小型 LED 光源，微型 CCD 和自聚焦透鏡整合到一個小于1cm3的框架之中，研制出了一個重量為1.9g 的微型寬場顯微鏡。該技術被用于研究大腦海馬區 place cell 等與記憶和本能相關的實驗當中3。然而，寬場成像方式由于不能很好的對離焦區域的背景信號進行過濾，并且對光的散射敏感，所以其無法達到細胞分辨率。更難以對更精細的諸如樹突，軸突，樹突棘等結構進行觀察。所以一直難以達到神經科學家滿意。

　　于是，從大概15年前開始，世界上一些研究和開發雙光子成像技術的研究組開始嘗試將雙光子顯微鏡這種在神經成像領域已經獲得廣泛應用的技術進行微型化。然而，目前只有為數不多的幾個課題組報道了他們在微型雙光子顯微鏡研制方面的進展: 在2001年，Denk 等的工作被認為是研制微型雙光子顯微鏡的第一步4。然而，它仍然太過“巨大”（長7.5厘米，重25克），而且成像速度很慢。之后，其他一些課題組相繼報道了不同的微型雙光子系統。由于微型雙光子顯微鏡一般需要利用光纖將飛秒激光導入到探頭之中，而光纖由于存在諸如色散、截至模式、導通帶寬等一系列限制，所以某一款光纖一般只允許一定帶寬（一般為幾十納米）和特定中心波長的光傳播。目前商業化的，可以用來進行飛秒光傳輸的空心光子晶體光纖（hollow-core Photonic Crystal Fiber， HC-PCF）種類非常有限。例如，全球最大的光子晶體光纖生產商NKT公司僅提供中心波長為800nm，1030nm，1300nm和1550nm的 HC-PCF。所有現有的微型雙光子顯微成像系統都是基于這幾款光纖所限定的中心波長進行開發的。但是很遺憾的是，本文上述所提到的目前最廣泛使用的 GcamP 指示劑需要920 nm的激光進行激發。所以先前的所有微型雙光子都不能對 Gcamp 進行有效的成像。這限制了微型雙光子顯微鏡的發展。

圖2 微型雙光子發展史上的幾個典型工作。a、b、c、d分別選自參考文獻4、5、6和7

　　所以，這些早期的微型化雙光子顯微鏡都無法得到真正的使用和推廣，其原因在于，若要制造出具有實用價值的微型雙光子顯微鏡，比研制單光子微型顯微鏡復雜和困難的多得多。微型雙光子顯微鏡需要需要解決如下幾個關鍵技術難題：

　　1 如何將飛秒激光有效的導入微型顯微鏡；

　　2 如何在微型顯微鏡內進行掃描/圖像重建；

　　3 如何在微型顯微鏡中進行高質量的激光匯聚，高效激發雙光子信號。

　　4 如何有效的對熒光信號進行收集；

　　5 如何使整個系統在動物劇烈運動時仍保持穩定

　　6 在滿足前5項條件下，重量是否足夠輕，以致盡量小地對動物的活動造成影響；

　　我所在的課題組，是由北京大學分子醫學研究所、信息科學技術學院、動態成像中心、生命科學學院、工學院聯合中國人民解放軍軍事醫學科學院組成跨學科團隊。我們在程和平院士的帶領下，在國家自然科學基金委國家重大科研儀器研制專項《超高時空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統》的支持下，歷經三年多的協同奮戰，成功研制了新一代高速高分辨微型雙光子熒光顯微鏡，并將其取名為FHIRM-TPM。原始論文于5月29日在線發表于自然雜志子刊Nature Methods8。在這項成果中，我們解決了上文所提及的早先微型化雙光子顯微鏡研制中存在的問題，獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經元和神經突觸活動清晰、穩定的圖像。

圖3 FIRM-TPM示意圖，來自8

　　新一代微型雙光子熒光顯微鏡體積小，重僅2.2克，適于佩戴在小型動物頭部，通過顱窗實時記錄數十個神經元、上千個神經突觸的動態信號。在大型動物上，還可望實現多探頭佩戴、多顱窗不同腦區的長時程觀測。相比單光子激發，雙光子激發具有良好的光學斷層、更深的生物組織穿透等優勢，所以成像質量遠優于目前領域內主導的、美國腦科學計劃核心團隊所研發的微型化寬場顯微鏡。其橫向分辨率達到0.65μm，與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美；采用雙軸對稱高速微機電系統轉鏡掃描技術，成像幀頻已達40Hz (256*256像素)，同時具備多區域隨機掃描和每秒1萬線的線掃描能力。最為重要的是，FHIRM-TPM 克服了先前限微型雙光子顯微鏡應用的兩個障礙。首先，我們定制設計的 HC-PCF 為920納米飛秒激光脈沖提供了無畸變傳輸，這種改進讓有效的激發例如 Thy1-GFP 和 GCaMP-6f 等常用熒光指示劑成為可能。第二，由于雙光子點掃描顯微鏡的高空間分辨率和層切能力，安裝到動物頭上的微型雙光子顯微鏡非常容易受到運動偽影的影響。為了解決這個問題，我們對整個系統進行了充分的優化：（a）使用柔軟的新型光纖束SFB來使得動物運動引起的扭矩和拉拽力最小化，并不降低光子收集效率； （b）采用獨立的可旋轉連接器來連接光學探頭上的光纖和電線，以使動物在自由探索期間線的扭曲和纏繞最小化；（c）使用高速成像以減少運動引起的幀內模糊。此外，我們在實驗之前預先訓練動物適應安裝在其頭骨上的微型顯微鏡，并滴加1.5％低熔點瓊脂糖使其充滿物鏡和腦組織之間，這些措施都顯著降低了探頭與大腦之間的相對運動，進而改善了實驗短期和長期的穩定性，于是實現了在動物進行包含大量身體和頭部運動的行為學試驗中中進行高分辨率成像。

圖4 FIRM-TPM實物圖8

　　樹突棘活動是神經元信息處理的基本事件，利用臺式雙光子顯微鏡在頭固定的動物上的研究表明單個神經細胞的不同樹突棘可以被不同朝向的視覺刺激或不同強度頻率的聲音刺激所激活。FHIRM-TPM 實現了與傳統的大型的臺式雙光子顯微鏡相同的分辨率和光學層切能力。與微型寬場顯微鏡相比，FIRM-TPM的高空間分辨率，固有的光學切片能力和組織穿透能力以及相當的機械穩定性都是極有優勢的。所以雖然通過微型寬場顯微鏡可以獲得數百個神經元在細胞水平上的活動，但是我們的 FHIRM-TPM 無疑提供了一個更加強大的工具，即在自由活動的動物中對更加基本的神經編碼單位——樹突棘的時空特性進行觀測。它能夠在對小鼠依次進行的行為學試驗（例如懸尾，跳臺，以及社交行為）的過程中長時間觀察位大腦中的神經元胞體、樹突和樹突棘的活動。這些功能的展示充分證明了 FHIRM-TPM 具有良好的性能和穩定性。未來，與光遺傳學技術的結合，可望在結構與功能成像的同時，精準地操控神經元和大腦神經回路的活動。微型雙光子熒光顯微鏡整機性能十分穩定，可用于在動物覓食、跳臺、打斗、嬉戲、睡眠等自然行為條件下，或者在學習前、學習中和學習后，長時程觀察神經突觸、神經元、神經網絡、遠程連接的腦區等多尺度、多層次動態變化。

圖5 三種模式在結構學成像中的成像質量對比，來自8

圖6 FHIRM-TPM在三種不同的行為學范例對小鼠大腦皮層神經元活動進行成像，來自8

　　縱觀這15年來微型雙光子顯微鏡的發展道路，中國，之前在這個領域基本上屬于完全的空白。更不要說什么領先世界。然而令人十分興奮的是，中國國家基金委國家重大科研儀器設備研制專項在2014年正式將“超高時空分辨微型雙光子在體顯微成像系統”立項，對這一項“世界上做的還并不怎么好，中國基本沒人做過”的技術進行攻關研發。這樣的大力投入無疑為這一領域注入了新鮮血液和十足動力。從2012年起，我正式加入了由首席負責人程和平院士和陳良怡研究員的聯合課題組，開始對微型化顯微鏡技術進行研發。

　　該成果在2016年底美國神經科學年會、2017年5月冷泉港亞洲腦科學專題會議上報告后，得到包括多位諾貝爾獎獲得者在內的國內外神經科學家的高度贊譽。冷泉港亞洲腦科學專題會議主席、美國著名神經科學家加州大學洛杉磯分校的Alcino J Silva教授在評述中寫道，“從任何一個標準來看，這款顯微鏡都代表了一項重大技術發明，必將改變我們在自由活動動物中觀察細胞和亞細胞結構的方式。它所開啟的大門，甚至超越了神經元和樹突成像。系統神經生物學正在進入一個新的時代，即通過對細胞群體中可辨識的細胞和亞細胞結構的復雜生物學事件進行成像觀測，從而更加深刻地理解進化所造就的大腦環路實現復雜行為的核心工程學原理。毫無疑問，這項非凡的發明讓我們向著這一目標邁進了一步。”

　　美國著名神經科學家 Alcino J Silva 發表了這樣的評論

　　 “By every standard, this microscope represents a fundamental discovery that willchange the way we image cellular and sub-cellular structures in behavinganimals. The doors that this microscope opens, go beyond imaging of neuronaland dendritic activity. Systems neuroscience is primed to enter a new era,where imaging of complex biological events in identified cells and subcellularstructures of cell ensembles, will bring us closer to the very engineeringprinciples that evolution designed to implement complex behaviors in braincircuits. This marvelous invention just got us a step closer to that goal.”

　　 “從任何一個標準來看，這款顯微鏡都代表了一項重大技術發明，必將改變我們在自由活動動物中觀察細胞和亞細胞結構的方式。它所開啟的大門，甚至超越了神經元和樹突成像。系統神經生物學正在進入一個新的時代，即通過對細胞群體中可辨識的細胞和亞細胞結構的復雜生物學事件進行成像觀測，從而更加深刻地理解進化所造就的大腦環路實現復雜行為的核心工程學原理。毫無疑問，這項非凡的發明讓我們向著這一目標邁進了一步。”

　　參考文獻：

　　1. Minderer, M., Harvey, C.D., Donato, F.& Moser, E.I. Neuroscience: Virtual reality explored. Nature 533, 324-325(2016).

　　2. Hamel, E.J., Grewe,B.F., Parker, J.G. & Schnitzer, M.J. Cellular level brain imaging inbehaving mammals: an engineering approach.Neuron86, 140-159 (2015).

　　3. Ghosh, K.K. et al.Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat Methods 8, 871-878(2011).

　　4. Helmchen, F., Fee,M.S., Tank, D.W. & Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon Microscope.Neuron 31, 903-912 (2001).

　　5. Engelbrecht, C.J.,Johnston, R.S., Seibel, E.J. & Helmchen, F. Ultra-compact fiber-optictwo-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Optics Express 16, 5556 (2008).

　　6. Piyawattanametha, W.et al. In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope basedon a microelectromechanical systems scanning mirror. Optics Letters 34, 2309(2009).

　　7. Sawinski, J. et al.Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals. Proceedings of the National Academy ofSciences 106, 19557-19562(2009).

　　8. Zong, W. et al. Fasthigh-resolution miniature two-photon microscopy for brain imaging in freelybehaving mice. Nat Methods(2017).