轉基因植物中的篩選基因

基因工程（DNA重組技術）是在離體條件下對不同生物的遺傳物質（DNA）進行人為“加工”，并按照人們的意愿重新組合，以改變生物的性狀和功能，然后再通過適當的載體將重組DNA轉入生物體或細胞內，并使其在生物體內或細胞中表達，從而獲得新的生物機能。這種利用基因工程技術獲得的植物一般稱為“基因工程植物”。自1983年首次獲得轉基因植物以來，便深受育種工作者青睞，得到了蓬勃地發展。至今已有30多科約200多種植物轉基因成功；國際上相繼有30多個國家批準3000多例轉基因植物進入田間試驗，并且在美國、加拿大、中國等20多個國家成功進行了商品化生產。通過基因工程改良作物品種在未來的農業生產中日益顯示出巨大潛力。

轉基因的方法很多，最常用的有農桿菌介導的遺傳轉化法和基因槍轉化法。無論哪種方法，轉化細胞與非轉化細胞相比都只占少數，兩者存在競爭，而作為異種細胞的轉化細胞的競爭力很弱。因此，必須對轉化細胞進行篩選。

在有選擇壓力的條件下，利用抗性基因在轉化體內的表達，有利于從大量的非轉化細胞中選擇出轉化克隆。目前使用的選擇性試劑主要有抗生素類、除草劑類、氨甲喋呤、氨基酸類。

1.   抗生素抗性基因：

npt, 新霉素磷酸轉移酶基因，對卡那霉素, G418, 巴龍霉素及新霉素等具有抗性；

aphIV, 潮霉素磷酸轉移酶基因，對潮霉素具有抗性；

spt, 鏈霉素磷酸轉移酶基因，對鏈霉素具有抗性；

cat, 氯霉素乙酰轉移酶基因，使氯霉素喪失抗菌素活性；

Aacc3和aacc4, 慶大霉素3-N-乙酰轉移酶基因，對慶大霉素有抗性；

ble, 博來霉素抗性基因，對博來霉素有抗性。

2.   抗除草劑抗性基因

bar, 編碼膦化麥黃酮乙酰轉移酶（PAT），使PPT（膦化麥黃酮）的自由氨基乙酰化而對PPT中毒。抗除草劑草丁膦和雙丙氨膦；

epsps, 草甘膦抗性標記基因，抗草甘膦；

als,綠黃隆抗性標記基因。

3.   顯色或發光報告基因

（1）GUS酶活性檢測

GUS使β－葡萄糖苷酶，能催化裂解一系列的葡萄糖苷，產生一系列具有發色基團或發熒光的物質，可用分光光度計、熒光計或組織化學法對GUS活性進行定量和空間定位分析，檢測方法簡單靈敏。

（2）熒光素酶活性檢測

熒光素酶催化的底物使6-羥基喹啉類似物，在鎂離子、ATP及氧的作用下酶使底物脫羧，生成激活態的氧化熒光素，發射光子后，轉變成常態的氧化熒光素。

（3）綠色熒光蛋白檢測

GFP產生綠色熒光蛋白，在395nm和490nm的波長下發出獨特的綠色熒光。

傳統的篩選方法是利用抗生素和除草劑類選擇劑，但這些物質對人類和環境的影響還不完全了解，因此，非抗生素篩選系統應運而生。

甘露糖陽性選擇系統屬于非抗生素篩選系統之一，其原理是：甘露糖不能維持各種外植體的生長。當培養植物細胞添加甘露糖時，它只被轉化為6-磷酸甘露糖，不能進一步參與代謝，而積累至毒性水平。科學家克隆編碼6-磷酸甘露糖異構酶的基因作選擇基因，構建表達載體遺傳轉化植物，用甘露糖作選擇劑，選擇基因編碼的6-磷酸甘露糖異構酶則可將6-磷酸甘露糖轉化為易于糖酵解的6-磷酸果糖。

和傳統的遺傳轉化方法相比，包含甘露糖選擇在內的新篩選方法有利于轉基因組織的再生和生長，同時使非轉基因組織因饑餓而死，而不是殺死它們，稱之為正向選擇法；傳統的抗生素選擇法或除草劑選擇法將未轉化細胞殺死則被叫做負向選擇法。