轉基因植物的GUS表達分析

實驗概要

本實驗對轉基因擬南芥進行了GUS組織化學染色分析及GUS活性測定。

主要試劑

X-Gluc，丙酮，乙醇，BSA，考馬斯亮藍溶液

主要設備

顯微鏡(BX50 OLYPUS)，研缽，高速離心機，Nano drop核酸蛋白測定儀

實驗材料

轉基因擬南芥

實驗步驟

1. 轉基因植物的GUS組織化學染色分析

   1) 配置染色液：

取9.7mL上述緩沖液(除X-Gluc外)，加0.3mL X-Gluc母液即可；

   2) 將材料在90%丙酮中(冰浴)輕微固定15-20min；

   3) 在緩沖液中(染色液去掉X-Gluc)漂洗3次，共計l0min；

   4) 將需要染色的擬南芥植株或組織放在1.5 mL離心管中，加入染色液浸過材料抽氣5-l0min， 37℃過夜，染色12-16h；

   5) 用50%，60%，70%，80%，90%乙醇依次脫水30min后，在100%乙醇中放置1h；觀察、照相(BX50 OLYPUS，顯微鏡)。

2. 轉基因植物的GUS活性測定

   1) 新鮮植物組織GUS蛋白的提取

取不同株系轉基因擬南芥組織約0.lg，用石英砂研磨；加入1mL提取緩沖液，研成勻漿；5000 rpm/min離心l0min，收集上清液，于-20℃冰箱中保存備用。

   2) GUS蛋白提取液的蛋白含量測定

取1ul GUS蛋白提取液點到Nano drop核酸蛋白測定儀上，測出蛋白濃度；

或者用Bradford法測定，方法如下：

      a. 制作標準曲線：配制25ug/mL BSA母液：稱取2.5mg BSA，加入0.5 mL提取緩沖液，用H₂O定容100mL，按下表制作BSA梯度液。從中取4mL加入1mL考馬斯亮藍溶液，混勻，室溫放置2min，測定595nm的吸收值。吸收值對蛋白濃度作圖繪制標準曲線。

      b. 取植物材料GUS提取液20uL，加H₂O至4mL，加入1mL考馬斯亮藍溶液，混勻，室溫下放置2min。測定595nm光吸收值，根據標準曲線計算樣品蛋白質含量。

   3) CUS酶活反應

      a. 將反應緩沖液于37℃預熱；

      b. 取數只1.5 mL離心管，分別加入900uL反應終止液，編號；

      c. 取1支離心管并加入900uL預熱的反應緩沖液，再加入100uL提取緩沖液，混勻，立即取出100uL加入到終止液中，此為反應。時的樣品，并開始嚴格記時；

      d. 終止液中將反應管放入37℃水浴中進行酶反應15min，之后取100uL反應液，加入到混勻，作為酶反應20min時的樣品，供熒光測定用；

      e. 在激發光365nm，發射光455nm，狹縫10nm條件下測各樣品的熒光，以反應0時樣品為空白溶液，測樣品熒光量。

   4) 酶活力計算：以酶反應時間對4-MU含量作圖，直線部分的斜率即為酶反應初始階段的速度。

酶活力單位定義為：每min水解4-MUG生成1mmol或1mg、1ug、1ng 4-MU的酶量為一個活力單位，根據定義求出各樣品的酶活力。