軟瓊脂克隆形成實驗

細胞樣品

胰蛋白酶 胎牛血清 GIMSA染液 PBS 純甲醇

培養皿 培養箱 顯微鏡

1. 取對數生長期的細胞，0.25％胰酶消化，離心收集細胞沉淀。

2. 完全培養基重懸，適當稀釋后活細胞計數，調整細胞密度至1×10³／ml。

3. 取0.5ml細胞懸液（即500個細胞），加入培養基，使體積達到9.4ml，37℃孵育。

4. 底層瓊脂的制備。5％瓊脂置沸水浴中，使之完全融化，取出1ml移人無菌小燒杯中，待冷卻到50℃時，迅速加入9ml預溫37℃的完全培養基，混勻后立即取0.8ml澆注24孔板，室溫凝固。

5. 上層瓊脂的制備。步驟3中預溫的9.4ml細胞懸液中加入0.6ml 50℃的5％瓊脂，迅速混勻，立即取0.8ml澆入24孔板，置室溫凝固。每孔即含有40個細胞，一般每個實驗組重復3個樣本。

6. 常規培養2——3周。

7. 將培養板置于顯微鏡下計數克隆數，每個細胞集落含50個或大于50個細胞為1個克隆，以公式集落數=n孔中細胞集落數總和／n，克隆形成率=集落數／接種細胞數x100％計算克隆形成率，最后拍照。

8. 統計學分析。根據集落數和克隆形成率進行t檢驗，分析不同組別之間的差異。

1. 取對數生長期的細胞，0.25％胰酶消化，離心收集細胞沉淀。

2. 完全培養基重懸，適當稀釋后活細胞計數，調整細胞密度至1×10³／ml。

3. 取0.5ml細胞懸液（即500個細胞），加入培養基，使體積達到9.4ml，37℃孵育。

4. 底層瓊脂的制備。5％瓊脂置沸水浴中，使之完全融化，取出1ml移人無菌小燒杯中，待冷卻到50℃時，迅速加入9ml預溫37℃的完全培養基，混勻后立即取0.8ml澆注24孔板，室溫凝固。

5. 上層瓊脂的制備。步驟3中預溫的9.4ml細胞懸液中加入0.6ml 50℃的5％瓊脂，迅速混勻，立即取0.8ml澆入24孔板，置室溫凝固。每孔即含有40個細胞，一般每個實驗組重復3個樣本。

6. 常規培養2——3周。

7. 將培養板置于顯微鏡下計數克隆數，每個細胞集落含50個或大于50個細胞為1個克隆，以公式集落數=n孔中細胞集落數總和／n，克隆形成率=集落數／接種細胞數x100％計算克隆形成率，最后拍照。

8. 統計學分析。根據集落數和克隆形成率進行t檢驗，分析不同組別之間的差異。

1. 在進行軟瓊脂克隆形成實驗時，首先細胞計數要準確，可以重復計數，取平均值。其次在實驗的操作過程中，很多步驟可能會引起污染，這個問題一定要注意。

2. 在將細胞懸液和瓊脂混合的時候，一定要把握好瓊脂的溫度，太高時，容易引起部分細胞死亡，太低則容易使局部結塊。

3. 關于選擇接種多少細胞的問題，24孔板一個孔，30——50個細胞已足夠。太少，結果不準確；太多，計數太麻煩。當然，這還要根據細胞增殖能力或者說惡性程度來決定。當細胞增殖能力非常強時，可選擇少接種一些細胞；當細胞增殖能力很弱時，可增加細胞接種數。

4.來源《分子生物學實用實驗技術》。