辛酸／硫酸銨法提純IgG

實驗概要

本實驗介紹了辛酸/硫酸銨法提純IgG的原理和主要步驟。

實驗原理

在酸性條件下( pH4.5)，非1gG的蛋白成份(包括白蛋白，部分Ig)，能被辛酸等短鏈脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要為IgG，再用硫酸銨沉淀上清，即可獲得純度較高的IgG。辛酸/硫酸銨法比硫酸銨法能夠獲得更高純度的IgG。

主要試劑

1. 辛酸(caprylic acid，CA)，化學純

2. 硫酸銨，分析純

3. 60mmo1/ L醋酸緩沖液(pH4.0)

4. NaOH

5. PBS(0.lmol/L，pH7.4)

6. 0.lmol/ L檸檬酸(pH4.0)

主要設備

1. SPA Sepharose 4FF親合層析柱

2. 紫外分光光度計

3. 高速離心機

4. 透析袋

5. 蛋白電泳裝置

6. 酶標板

實驗材料

動物腹水

實驗步驟

1. 蛋白含量測定

紫外分光光度法測樣品在波長260nm，280nm處的I及收光度(A 260，A 280)，蛋白含量按以下公式計算

蛋白量（g/L）=(1.45* A 280- 0.74* A 260)*稀釋倍數

2. 主要步驟

   1) 腹水濾紙過濾去沉淀和脂質，濾液用4倍體積60mmo1/ L醋酸緩沖液(pH4.0)稀釋后，用NaOH調，PH值至4.5。

   2) 逐滴加入辛酸(終濃度25u1/ml)，室溫h攪拌30分鐘后，以6000-8000r/min.離心30分鐘，收集上清液。

   3) 上清液經濾紙過濾2次，將濾液與10*PBS(0.lmol/L，pH7.4)按10:1比例混合，調pH至7.4，置冰浴冷至40度。

   4) 每毫升上述混合液加0.2778固體硫酸錢，40度攪拌30分鐘，以4000-6000r/min離心20分鐘，將沉淀溶于少量YBS，透析，測蛋白含量，凍存。

3. 硫酸銨沉淀法

按常規方法將腹水分別經50%，33%飽和度硫酸銨沉淀。

4. 親合層析

取提取的樣品，用0.01lmol/ L Na₂HPO₄ (pH7.4)透析，洗脫使樣品中IgG結合于層析柱上，再用0.lmol/ L檸檬酸(pH4.0)洗脫，收集洗脫液即獲純化IgG。

5. SDS—PAGE電泳鑒定抗體純度

6. 間接ELISA法測定抗體效價

用sIgA包被酶標板，按常規方法測抗體效價。處理細胞，包被酶標板，測定抗體效價。

7. 得率和回收率的計算

每毫升原腹水中提取的抗體量即為得率(Y field，g/ L );提取所得抗體量與原腹水中抗體量之百分比即為回收率(Recovery，%)。