通常來說，退火溫度是由引物的GC%含量決定的，但是反應體系的條件改變也會影響引物的退火溫度（如Mg,Na等離子濃度）。建議你去http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/分析一下你的PCR體系中的引物退火溫度，而不是僅僅由公式計算得出。一般情況下，退火溫度過低只會導致反應體系中引物與DNA模板的非特異性結合，致使反應結果中出現大量非特異性結合條帶。但是，你所需的產物也應該是包含在其中的，如果完全沒有結果，說明你反應體系中其他步驟還存在問題，例如擴增時間等比較關鍵的步驟。
另：不同的hot taq酶對Tm要求也是不同的。例如今年clontech新出了一種十分nb的hot taq酶，它需要的Tm溫度是引物Tm溫度再高5度。所以，弄清楚你試劑盒的反應條件要求也是很有必要的...