逆轉錄（RT）實驗步驟

一、準備工作

1、實驗器具與材料：

（1）移液槍：200ul、10ul

（2）吸頭：200ul、20ul

（3）EP管1。5ml、100ul

（4）水浴箱

2、實驗器具的處理與準備

塑料制品：（包括吸頭、EP管等）

將塑料制品逐個浸泡于1‰DEPC水中（必要時小槍頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過夜，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時左右烘干），試驗前將槍頭放入吸頭臺。

3、試劑配制和準備：

（1）DEPC水：泡實驗器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時后備用。逆轉錄中所用的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶內裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過夜，送至高壓，后分裝到幾個1。5mlEP管中，-20℃中保存備用。

（2）RT中所需要的各種試劑

（3）引物濃度計算方法：（新合成的引物的稀釋）假如終濃度為XuM（pmol/ul）加DEPC水體積（ul）=（OD×33×1000000）/（分子量×X）

二、RT時注意事項：

為避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。

三、RT步驟

（一）用SSⅢ逆轉錄酶進行RT（20ul體積）

1、準備0、65ml的EP管

2、冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暫離心。

3、65℃水浴5分鐘后，立刻0℃冰水浴至少1分鐘。

4、短暫離心后，冰上操作：加入4ul5×First-StrandBuffer，1ul0.1MDTT，1ulRNAse Inhibitor，1ulSSⅢ逆轉錄酶。

5、短暫離心

6、50℃水浴60分鐘進行逆轉錄。

7、70℃水浴15分鐘滅活逆轉錄酶

8、－20℃保存，或立即進行PCR。

（二）用AMV逆轉錄酶進行RT（10ul體積）

1、準備0.65mlEP管

2、加入4.5ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA

3、稍離心，100℃沸水裕1min

4、加入0.5uldNTP，2ul5×Buffer，1ulAMV逆轉錄酶

5、稍離心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT

6、100℃沸水裕3min滅活AMV

7、立即PCR或－20℃保存。