由一條RNA單鏈轉錄為互補DNA（cDNA）稱作“逆轉錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉錄酶）來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個循環倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互補DNA。
RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術，可以檢測很低拷貝數的RNA。RT-PCR廣泛應用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監測某種RNA的含量。檢測基因表達的方法，參見Northern Blot法。
RT-PCR的關鍵步驟是在RNA的反轉錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質等雜質。常用的反轉錄酶有兩種，即鳥類成髓細胞性白細胞病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）反轉錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MMLV）反轉錄酶。
在完成逆轉錄過程之后，通過PCR進行定量分析的時候，隨著技術的發展，real-time PCR（實時熒光PCR）或ddPCR（數字PCR）技術也被用來做定量分析，它們比普通PCR進行定量分析時靈敏度更高，定量更精確。